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田村 厚夫大学院理学研究科 化学専攻准教授
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■ 受賞- 2018年05月 日本生化学会 近畿支部, 第65回 日本生化学会 近畿支部例会 優秀発表賞, pH応答性構造転移能および膜破壊能を有するペプチドの分子設計国内学会・会議・シンポジウム等の賞
- 2017年06月 日本生化学会近畿支部, 第64回日本生化学会近畿支部例会 優秀発表賞, 耐熱性ナノファイバーを形成する両親媒性ヘリックスペプチドの分子設計国内学会・会議・シンポジウム等の賞
- 2024年04月, 熱測定, 51(2) (2), 85 - 90, 日本語人工設計αヘリックス型ペプチドナノファイバーの超耐熱性化と液晶性の獲得[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The 21-residue peptide α3, which is artificially designed and consists of three repeats of 7 residues, is known to rapidly assemble into the α-helix nanofiber. However, its molecular structure within the fiber has not yet been fully elucidated. Thus, we conducted a thorough investigation of the fiber's molecular structure using solid-state NMR and other techniques. The molecules were found to be primarily composed of the α-helix structure, with some regions near the C- and N-terminal adopting a 310-helix structure. Furthermore, it was discovered that β-sheet hydrogen bonds were formed between the molecules at both ends. These intermolecular interactions caused the molecules to assemble parallelly in the same direction, forming helical fibers. In contrast, we designed two molecules, CaRP2 and βKE, that can form β-sheet intermolecular hydrogen bonds using the entire molecule instead of just the ends. Cryo-EM and other measurements confirmed that the nanofibers formed in a cross β structure, albeit at a slow rate, with the formation times ranging from 1 to 42 days. To create peptide nanofibers that instantaneously respond to changes in the external environment, we designed several molecules (HDM1-3) based on α3 by introducing metal-binding sites. One of these molecules was found to be highly responsive to the addition of metal ions, inducing α-helix formation and simultaneously assembling into nanofibers. The nanofibers lost their structure upon removal of the metal ion. The change occurred promptly and was reversible, demonstrating that the intended level of responsiveness was attained.2024年01月, International journal of molecular sciences, 25(2) (2), 1111 - 1130, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Structural and thermodynamic transitions of artificially designed α-helical nanofibers were investigated using eight peptide variants, including four peptides with amide-modified carboxyl termini (CB peptides) and four unmodified peptides (CF peptides). Temperature-dependent circular dichroism spectroscopy and differential scanning calorimetry showed that CB peptides exhibit thermostability up to 50 °C higher than CF peptides. As a result, one of the denaturation temperatures approached nearly 130 °C, which is exceptionally high for a biomacromolecule. Thermodynamic analysis and microscopy observations also showed that CB peptides undergo a thermal transition similar to the phase transition in liquid crystals. In addition, one of the peptides showed a sharp and highly cooperative transition with a small enthalpy change at around 25 °C, which was ascribed to a giga-bundle burst of the molecular assembly. These macroscopic changes in the thermostability and crystallinity of CB peptides may be attributed to an increased amphiphilicity of the molecule in the direction of the helix axis, originating from the microscopic modification of the carboxyl-terminus.2023年10月, The journal of physical chemistry. B, 127(39) (39), 8331 - 8343, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- American Chemical Society (ACS), 2022年09月, JACS Au, 2(9) (9), 2023 - 2028研究論文（学術雑誌）
- American Chemical Society (ACS), 2022年08月, The Journal of Physical Chemistry B, 126(31) (31), 5793 - 5802研究論文（学術雑誌）
- Amyloid fibrils have been an important subject as they are involved in the development of many amyloidoses and neurodegenerative diseases. The formation of amyloid fibrils is typically initiated by nucleation, whereas its exact mechanisms are largely unknown. With this situation, we have previously identified prefibrillar aggregates in the formation of insulin B chain amyloid fibrils, which have provided an insight into the mechanisms of protein assembly involved in nucleation. Here, we have investigated the formation of insulin B chain amyloid fibrils under different pH conditions to better understand amyloid nucleation mediated by prefibrillar aggregates. The B chain showed strong propensity to form amyloid fibrils over a wide pH range, and prefibrillar aggregates were formed under all examined conditions. In particular, different structures of amyloid fibrils were found at pH 5.2 and pH 8.7, making it possible to compare different pathways. Detailed investigations at pH 5.2 in comparison with those at pH 8.7 have suggested that the evolution of protofibril-like aggregates is a common mechanism. In addition, different processes of evolution of the prefibrillar aggregates have also been identified, suggesting that the nucleation processes diversify depending on the polymorphism of amyloid fibrils.MDPI AG, 2022年06月, Molecules, 27(13) (13), 3964 - 3964研究論文（学術雑誌）
- 2021年06月, バイオインダストリー, 38(6) (6), 1 - 8, 日本語人工設計ペプチドによる脂肪分解[招待有り]研究論文（学術雑誌）
- Self-assembly of synthetic molecules has been drawing broad attention as a novel emerging approach in drug discovery. Here, we report selective cell death induced by a novel peptide amphiphile that self-assembles to form entangled nanofibers (hydrogel) based on intracellular pH (pHi). We found that a palmitoylated hexapeptide (C16-VVAEEE) formed a hydrogel below pH 7. The formation of the nanofibrous self-assembly was responsive to a small pH change around pH 7. The cytotoxicity of C16-VVAEEE was correlated with pHi of cells. Microscope observation demonstrated the self-assembly of C16-VVAEEE inside HEK293 cells. In vivo experiments revealed that the transcutaneous administration of C16-VVAEEE showed remarkable anti-tumor activity. This study proposes that distinct microenvironment inside living cells can be used as a trigger for the intracellular self-assembly of a peptide amphiphile, which provide a new clue to drug discovery.2021年05月, Biomacromolecules, 22(6) (6), 2524 - 2531, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- American Chemical Society (ACS), 2021年03月, ACS Applied Bio Materials, 4(3) (3), 2442 - 2452, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2019年07月, Biochemistry, 58(24) (24), 2769 - 2781, 英語Structural insights into the inhibition of amyloid fibril formation by fibrinogen via interaction with prefibrillar intermediates[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2018年01月, Sci. Rep., 8, 62, 英語A specific form of prefibrillar aggregates that functions as a precursor of amyloid nucleation[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- We have performed dielectric spectral measurements of lysozyme in a solid state to understand the effects of hydration and thermal excitation on the low-frequency dynamics of protein. Dielectric measurements were performed under changing hydration conditions at room temperature in the frequency region of 0.5 GHz to 1.8 THz. We also studied the temperature dependence (83 to 293 K) of the complex dielectric spectra in the THz frequency region (0.3 THz to 1.8 THz). Spectral analyses were performed using model functions for the complex dielectric constant. To reproduce the spectra, we found that two relaxational modes and two underdamped modes are necessary together with an ionic conductivity term in the model function. At room temperature, the two relaxational modes have relaxation times of similar to 20 ps and similar to 100 ps. The faster component has a major spectral intensity and is suggested to be due to coupled water-protein motion. The two underdamped modes are necessary to reproduce the temperature dependence of the spectra in the THz region satisfactorily. The protein dynamical transition is a well-known behavior in the neutron-scattering experiment for proteins, where the atomic mean-square displacement shows a sudden change in the temperature dependence at approximately 200 K, when the samples are hydrated. A similar behavior has also been observed in the temperature dependence of the absorption spectra of protein in the THz frequency region. From our broadband dielectric spectroscopic measurements, we conclude that the increase in the spectral intensities in the THz region at approximately 200 K is due to a spectral blue-shift of the fast relaxational mode.AMER CHEMICAL SOC, 2016年06月, JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B, 120(21) (21), 4743 - 4755, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 公益社団法人 応用物理学会, 2016年03月, 応用物理学会学術講演会講演予稿集, 2016.1, 162 - 162, 日本語
- We have studied temperature and hydration dependent low-frequency spectra of lipid bilayers of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoryl-3'-rac-glycerol (DMPG) and 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) by terahertz time-domain spectroscopy (THz-TDS). We measured X-ray diffraction patterns and mid-infrared spectra of these lipid bilayers and found that the lipid bilayers have two different types of phases, i.e., the gel phase and the crystalline phase, depending on the preparation methods of the samples. In both phases, a few distinct bands were observed in the THz region. For DMPG, the peak wavenumbers of the absorption bands did not change upon hydration, while the bandwidth in the crystalline phase was smaller than that in the gel phase. We performed spectral analyses for the complex dielectric spectra for DMPG and DMPC with a model function, mainly to determine the peak wavenumbers of the absorption bands. In contrast to the case of the DMPG bilayers, the peak wavenumber of the absorption band of the DMPC bilayer shifts upon hydration. In the hydrated DMPC bilayer, it was suggested fast reorienting water molecules exist with a relaxation time of sub-picoseconds. It is suggested that the THz absorption patterns reflect the lipid packing pattern in the bilayers. The temperature dependence of the absorption band was analyzed by an empirical equation, and the anharmonicity of the vibrational potential of the low-frequency mode was quantitatively evaluated.AMER CHEMICAL SOC, 2015年07月, JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B, 119(29) (29), 9359 - 9368, 英語[査読有り][招待有り]研究論文（学術雑誌）
- ACS Publications, 2014年12月, J. Phys. Chem.B, 118, 48, 英語Temperature and Hydration Dependence of Low-Frequency Spectra of Lipid Bilayers Studied by Terahertz Time-Domain Spectroscopy[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- We have designed a-helical peptides de novo that can induce aggregation of various kinds of cells by focusing on physicochemical properties such as hydrophobicity, net charges, and amphipathicity. It is shown that peptide hydrophobicity is the key factor to determine capabilities for cell aggregation while peptide net charges contribute to nonspecific electrostatic interactions with cells. On the other hand, amphipathic peptides tend to exhibit cytotoxicity such as antimicrobial activity and hemolysis, which are competitive with cell-aggregation capabilities. Different from the cases of living cells, aggregation of artificial anionic liposomes appears to be mainly determined by electrostatic interactions. This discrepancy might be due to the complex structure of surfaces of cell membranes consisting of macromolecular chains such as peptidoglycans, polysaccharides, or glycocalyx, which coexist with lipid bilayers. design peptides that lead aggregation of living cells without cytotoxicity. Our design strategy would pave the Way to design peptides that lead aggregation of living cells without cytotoxicity.AMER CHEMICAL SOC, 2014年02月, BIOMACROMOLECULES, 15(2) (2), 512 - 523, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- We have investigated the low-frequency spectra of a phospholipid bilayer composed of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) by terahertz time-domain spectroscopy (THz-TDS). We focused on the temperature and hydration dependence of the low-frequency spectra of a gel-phase sample. The spectra of the dehydrated and hydrated samples showed shoulder bands at 45 and 30 cm(-1), respectively. In contrast to the dehydrated sample, in the hydrated sample spectra the slope of the temperature change of the absorption coefficient increased sharply around 240 K. This result suggests that water molecules affect the change in the low-frequency dynamics. We obtained the absorption coefficient difference spectra for different hydration levels to clarify the mechanism of the spectral change.SPRINGER, 2014年01月, JOURNAL OF INFRARED MILLIMETER AND TERAHERTZ WAVES, 35(1) (1), 147 - 157, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Mutational activation of the Ras oncogene products (H-Ras, K-Ras, and N-Ras) is frequently observed in human cancers, making them promising anticancer drug targets. Nonetheless, no effective strategy has been available for the development of Ras inhibitors, partly owing to the absence of well-defined surface pockets suitable for drug binding. Only recently, such pockets have been found in the crystal structures of a unique conformation of Ras center dot GTP. Here we report the successful development of small-molecule Ras inhibitors by an in silico screen targeting a pocket found in the crystal structure of M-Ras center dot GTP carrying an H-Ras-type substitution P40D. The selected compound Kobe0065 and its analog Kobe2602 exhibit inhibitory activity toward H-Ras center dot GTP-c-Raf-1 binding both in vivo and in vitro. They effectively inhibit both anchorage-dependent and -independent growth and induce apoptosis of H-ras(G12V)-transformed NIH 3T3 cells, which is accompanied by down-regulation of downstream molecules such as MEK/ERK, Akt, and RalA as well as an upstream molecule, Son of sevenless. Moreover, they exhibit antitumor activity on a xenograft of human colon carcinoma SW480 cells carrying the K-ras(G12V) gene by oral administration. The NMR structure of a complex of the compound with H-Ras center dot GTP(T35S), exclusively adopting the unique conformation, confirms its insertion into one of the surface pockets and provides a molecular basis for binding inhibition toward multiple Ras center dot GTP-interacting molecules. This study proves the effectiveness of our strategy for structure-based drug design to target Ras center dot GTP, and the resulting Kobe0065-family compounds may serve as a scaffold for the development of Ras inhibitors with higher potency and specificity.NATL ACAD SCIENCES, 2013年05月, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 110(20) (20), 8182 - 8187, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2013年, 生物物理, 53(1) (1), S220, 英語
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2013年, 生物物理, 53(1) (1), S128, 英語
- Temperature- and hydration-dependent terahertz spectra of hen egg white lysozyme were obtained by using terahertz time-domain spectroscopy. Analysis of the complex dielectric spectra indicated hydration-water dynamics at around 2 picoseconds were thermally activated above 230 K upon hydration. © 2013 IEEE.2013年, International Conference on Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves, IRMMW-THz, 英語[査読有り]研究論文（国際会議プロシーディングス）
- We studied low-frequency spectra of hydration water molecules around the hydrophobic probe in an aqueous solution by using tetraalkylammonium cation as a probe and terahertz time-domain spectroscopic technique. The phenomenon, called dynamical transition, has been known to be universally observed among proteins and polypeptides. In this work we investigated temperature and hydration dependence of low-frequency dynamics to clarify relationships between the dynamical transition and protein structures, and its functional states. We also mention general behaviors of the low-frequency spectra of globular proteins.SPIE-INT SOC OPTICAL ENGINEERING, 2013年, ULTRAFAST PHENOMENA AND NANOPHOTONICS XVII, 8623, 英語[査読有り]研究論文（国際会議プロシーディングス）
- Peptide nanotubes are self-assembled fibrous materials composed of cyclic polypeptides. Recently, various aspects of peptide nanotubes have been studied, in particular the utility of different methods for making peptide nanotubes with diverse designed functions. In order to investigate the relationship between formation, function and stability, it is essential to analyze the precise structure of peptide nanotubes. Atomic-scale surface imaging in liquids was recently achieved using frequency modulation atomic force microscopy with improved force sensing. Here we provide a precise surface structural analysis of peptide nanotubes in water without crystallizing them obtained by imaging the nanotubes at the subnanometer scale in water. In addition, the local hydration structure around the peptide nanotubes was observed at the nanotube/water interface. © 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.Elsevier B.V., 2013年, Chemical Physics, 419, 74 - 77, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- GTP-bound Ras adopts two interconverting conformations, "inactive" state 1 and "active" state 2. However, the tertiary structure of wild-type (WT) state 1 remains unsolved. Here we solve the state 1 crystal structures of H-Ras WT together with its oncogenic G12V and Q61L mutants. They assume open structures characterized by impaired interactions of both Thr-35 in switch I and Gly-60 in switch II with the gamma-phosphate of GTP and possess two surface pockets of mutually different shapes unseen in state 2, a potential target for selective inhibitor development. Furthermore, they provide a structural basis for the low GTPase activity of state 1. (c) 2012 Federation of European Biochemical Societies. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE BV, 2012年06月, FEBS LETTERS, 586(12) (12), 1715 - 1718, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2012年, 生物物理, 52, S28, 英語
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2012年, 生物物理, 52, S167 - S168, 英語
- We have investigated low-frequency spectra of poly-L-glutamic acid (polyE) in the powder state by terahertz time-domain spectroscopy (THz-TDS). Samples with three different secondary structures (alpha-helix, beta-sheet, and random-coil) and different chain lengths were prepared to investigate the dependence of the THz spectra on temperature and hydration. The temperature dependence of the THz absorption spectra clearly shows that polyE, regardless of its secondary structure, undergoes dynamical transition between 190 and 240 K. We have estimated the apparent activation energy and transition temperature by phenomenological spectral analysis. We also have estimated the effective dipole moment of the amino acid residue from the real part of the dielectric permittivity at zero frequency. Both results show that the transition temperature is lower when the secondary structure undergoes a transition from a random-coil structure to an alpha-helix or beta-sheet structure. Furthermore, both hydrating water molecules and peptide hydrogen bonds contribute to induce anharmonicity in the low-frequency vibrational motions. Meanwhile, hydration, not peptide hydrogen bonds, is crucial for the dynamical transition to occur because the onset of anharmonicity was observed only when the polypeptide is hydrated. An apparent intermolecular vibrational mode in the beta-sheet structure, which suggests a highly ordered structure in the sample, did not exhibit anharmonicity at the tested temperatures and humidity levels. This result suggests that short-range or inter-strand hydrogen bonds of the alpha-helix or low-ordered beta-sheet structures gave rise to the lower transition temperatures and the smaller effective activation energies compared with those of the random-coil structure.ROYAL SOC CHEMISTRY, 2012年, SOFT MATTER, 8(6) (6), 1997 - 2006, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Ras small GTPases undergo dynamic equilibrium of two interconverting conformations, state 1 and state 2, in the GTP-bound forms, where state 2 is recognized by effectors, whereas physiological functions of state 1 have been unknown. Limited information, such as static crystal structures and (31)P NMR spectra, was available for the study of the conformational dynamics. Here we determine the solution structure and dynamics of state 1 by multidimensional heteronuclear NMR analysis of an H-RasT35S mutant in complex with guanosine 5'-(beta, gamma-imido)triphosphate (GppNHp). The state 1 structure shows that the switch I loop fluctuates extensively compared with that in state 2 or H-Ras-GDP. Also, backbone (1)H, (15)N signals for state 2 are identified, and their dynamics are studied by utilizing a complex with c-Raf-1. Furthermore, the signals for almost all the residues of H-Ras.GppNHp are identified by measurement at low temperature, and the signals for multiple residues are found split into two peaks corresponding to the signals for state 1 and state 2. Intriguingly, these residues are located not only in the switch regions and their neighbors but also in the rigidly structured regions, suggesting that global structural rearrangements occur during the state interconversion. The backbone dynamics of each state show that the switch loops in state 1 are dynamically mobile on the picosecond to nanosecond time scale, and these mobilities are significantly reduced in state 2. These results suggest that multiconformations existing in state 1 are mostly deselected upon the transition toward state 2 induced by the effector binding.AMER SOC BIOCHEMISTRY MOLECULAR BIOLOGY INC, 2011年11月, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 286(45) (45), 39644 - 39653, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- GTP-bound forms of Ras family small GTPases exhibit dynamic equilibrium between two interconverting conformations, "inactive" state 1 and "active" state 2. A great variation exists in their state distribution; H-Ras mainly adopts state 2, whereas M-Ras predominantly adopts state 1. Our previous studies based on comparison of crystal structures representing state 1 and state 2 revealed the importance of the hydrogen-bonding interactions of two flexible effector-interacting regions, switch I and switch II, with the gamma-phosphate of GTP in establishing state 2 conformation. However, failure to obtain both state structures from a single protein hampered further analysis of state transition mechanisms. Here, we succeed in solving two crystal structures corresponding to state 1 and state 2 from a single Ras polypeptide, M-RasD41E, carrying an H-Ras-type substitution in residue 41, immediately preceding switch I, in complex with guanosine 5'-(beta,gamma-imido)triphosphate. Comparison among the two structures and other state 1 and state 2 structures of H-Ras/M-Ras reveal two new structural features playing critical roles in state dynamics; interaction of residues 31/41 (H-Ras/M-Ras) with residues 29/39 and 30/40, which induces a conformational change of switch I favoring its interaction with the gamma-phosphate, and the hydrogen-bonding interaction of switch II with its neighboring alpha-helix, alpha 3-helix, which induces a conformational change of switch II favoring its interaction with the gamma-phosphate. The importance of the latter interaction is proved by mutational analyses of the residues involved in hydrogen bonding. These results define the two novel functional regions playing critical roles during state transition.AMER SOC BIOCHEMISTRY MOLECULAR BIOLOGY INC, 2011年04月, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 286(17) (17), 15403 - 15412, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2011年, 生物物理, 51, S135, 英語
- Low-frequency dynamics of functional proteins studied by terahertz time-domain spectroscopyWe applied terahertz time-domain spectroscopy on myosin II subfragment1 (S1) to monitor temperature and hydration dependence of its low-frequency dynamics. In the absorption spectra of both apo and holo S1 (ATP-free and bound form, respectively), so-called dynamical transition was observed at around 190 K only when they are hydrated.IEEE, 2011年, 2011 36TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON INFRARED, MILLIMETER, AND TERAHERTZ WAVES (IRMMW-THZ), 英語[査読有り]研究論文（国際会議プロシーディングス）
- 2011年01月, J. Biol. Chem, 286(45) (45), 39644 - 39653, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Poly-L-lysine is known to have three different secondary structures depending on solvent conditions because of its flexible nature. In previous work (Kambara et al., Phys Chem Chem Phys 2008, 10, 5042-5044), we observed two different types of structural changes in poly-L-lysine. In the present study, we investigated the low-frequency spectrum of poly-L-lysine with a beta-sheet structure in the solid state by terahertz time-domain spectroscopy. On the basis of this spectroscopic analysis, we found that the low-frequency dynamics differed from those of other polypeptides. Furthermore, we performed powder X-ray diffraction measurement on poly-L-lysine, which was found to be highly amorphous compared with other polypeptides. (C) 2010 Wiley Periodicals, Inc. Biopolymers 93: 735-739, 2010.JOHN WILEY & SONS INC, 2010年08月, BIOPOLYMERS, 93(8) (8), 735 - 739, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Ras family small GTPases assume two interconverting conformations, "inactive" state 1 and "active" state 2, in their GTP-bound forms. Here, to clarify the mechanism of state transition, we have carried out x-ray crystal structure analyses of a series of mutant H-Ras and M-Ras in complex with guanosine 5'-(beta,gamma-imido) triphosphate (GppNHp), representing various intermediate states of the transition. Crystallization of H-RasT35S-GppNHp enables us to solve the first complete tertiary structure of H-Ras state 1 possessing two surface pockets unseen in the state 2 or H-Ras-GDP structure. Moreover, determination of the two distinct crystal structures of H-RasT35S-GppNHp, showing prominent polysterism in the switch I and switch II regions, reveals a pivotal role of the guanine nucleotide-mediated interaction between the two switch regions and its rearrangement by a nucleotide positional change in the state 2 to state 1 transition. Furthermore, the (31)P NMR spectra and crystal structures of the GppNHp-bound forms of M-Ras mutants, carrying various H-Ras-type amino acid substitutions, also reveal the existence of a surface pocket in state 1 and support a similar mechanism based on the nucleotide-mediated interaction and its rearrangement in the state 1 to state 2 transition. Intriguingly, the conformational changes accompanying the state transition mimic those that occurred upon GDP/GTP exchange, indicating a common mechanistic basis inherent in the high flexibility of the switch regions. Collectively, these results clarify the structural features distinguishing the two states and provide new insights into the molecular basis for the state transition of Ras protein.AMER SOC BIOCHEMISTRY MOLECULAR BIOLOGY INC, 2010年07月, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285(29) (29), 22696 - 22705, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Although several low amphipathic peptides have been known to exhibit antimicrobial activity, their mode of action has not been completely elucidated. In this study, using designed low amphipathic peptides that retain different alpha-helical content and hydrophobicity, we attempted to investigate the mechanism of these properties. Calorimetric and thermodynamic analyses demonstrated that the peptides induce formation of two lipid domains in an anionic liposome at a high peptide-to-lipid ratio. On the other hand, even at a low peptide-to-lipid ratio, they caused minimal membrane damage, such as flip-flop of membrane lipids or leakage of calcein molecules from liposomes, and never translocated across membranes. Interaction energies between the peptides and anionic liposomes showed good correlation with antimicrobial activity for both Escherichia coli and Bacillus subtilis. We thus propose that the domain formation mechanism in which antimicrobial peptides exhibit activity solely by forming lipid domains without membrane damage is a major determinant of the antimicrobial activity of low amphipathic peptides. These peptides appear to stiffen the membrane such that it is deprived of the fluidity necessary for biological functions. We also showed that to construct the lipid domains, peptides need not form stable and cooperative structures. Rather, it is essential for peptides to only interact tightly with the membrane interface via strong electrostatic interactions, and slight differences in binding strength are invoked by differences in hydrophobicity. The peptides thus designed might pave the way for "clean" antimicrobial reagents that never cause release of membrane elements and efflux of their inner components. (C) 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE INC, 2010年05月, PEPTIDES, 31(5) (5), 794 - 805, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- It was recently reported that the designed peptide, whose sequence is INYWLAHAKAGYIVHWTA, has both of the two structures, alpha-helix and beta-hairpin, in aqueous solution. However, the detailed transformation between these two structures is still unclear. In order to study this transformation, we applied a generalized-ensemble simulation to the designed peptide in aqueous solution and deduced the pathways of the designed peptide between alpha-helix structures and beta-hairpin structures.AMER CHEMICAL SOC, 2010年04月, JOURNAL OF CHEMICAL THEORY AND COMPUTATION, 6(4) (4), 979 - 983, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2010年, 生物物理, 50(2) (2), S154, 英語
- Terahertz Time-Domain Spectroscopy on Proteins, Peptides, and Small Biological MoleculesAbsorption coefficients and refractive indices of biologically important macromolecules such as lysozyme and myoglobin and small molecules such as adenosine triphosphate (ATP) have been obtained in the low-frequency region by terahertz time-domain spectroscopy (THz-TDS) to understand molecular dynamics and interactions of these molecules.IEEE, 2010年, 35TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON INFRARED, MILLIMETER, AND TERAHERTZ WAVES (IRMMW-THZ 2010), 英語[査読有り]研究論文（国際会議プロシーディングス）
- To elucidate the architectural principle of protein structure, we focused on sequestration from solvent, which is a common characteristic of folding and self-associative precipitation. Because protein solubility can be regarded as a basis for the potential ability to sequester from solvent, we assume that poorly soluble proteins tend not only to precipitate, but also to form solution structures. To examine this, the solubility of a 25-residue, natively unfolded protein, modified from a zinc-finger domain of transcription factor Sp1, was disturbed by adding a seven-residue hydrophobic peptide fragment to the C-terminus. NMR and ultracentrifuge measurements of the resulting sequence showed that a dissolved species forms an alpha-helical structure in a 15-20 molecule oligomer. To elucidate the mechanism by which the structure forms, we prepared two variants in which the added fragments are less hydrophobic; the structural stabilities were then measured at various pH values. A fairly good correlation was observed between stability and hydration potential, whereas a much stronger correlation was observed between stability and solubility, indicating that the stability is more strongly dependent on the ability to precipitate than on dehydration. These results show that, among poorly soluble protein molecules, dissolved species can be transformed from the solvent-exposed unfolded state into a loosely packed structure via intermolecular interactions. Because decreasing the protein solubility does not require the primary sequence to have a sophisticated design, such a protein structure might form readily and frequently, compared with the well-packed structure found in native proteins.WILEY-BLACKWELL PUBLISHING, INC, 2009年04月, FEBS JOURNAL, 276(8) (8), 2336 - 2347, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- We show that a series of peptides corresponding to individual beta-strands in native beta-lactoglobulin readily form amyloid aggregates and that such aggregates are capable of seeding fibril formation by a full-length form of beta-lactoglobulin in which the disulfide bonds are reduced. By contrast, preformed fibrils corresponding to only one of the beta-strands that we considered, beta A, were found to promote fibril formation by a full-length form of beta-lactoglobulin in which the disulfide bonds are intact. These results indicate that regions of high intrinsic aggregation propensity do not give rise to aggregation unless at least partial unfolding takes place. Furthermore, we found that the high aggregation propensity of one of the edge strands, beta I, promotes dimerisation of the native structure rather than misfolding and aggregation since the structure of beta 1 is stabilised by the presence of a disulfide bond. These findings demonstrate that the interactions that promote folding and native-state oligomerisation can also result in high intrinsic amyloidogenicity. However, we show that the presence of the remainder of the sequence dramatically reduces the net overall aggregation propensity by negative design principles that we suggest are very common in biological systems as a result of evolutionary processes. (c) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.ACADEMIC PRESS LTD ELSEVIER SCIENCE LTD, 2009年02月, J. Mol. Biol., 386(3) (3), 878 - 890, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2009年, 生物物理, 49, S76 - S77, 英語
- Previous P-31 NMR studies revealed that small GTPases H-Ras and K-Ras in complex with GTP assume two interconverting conformational states, state I and state 2. While state 2 corresponds to an active conformation, little is known about the function of state 1, an inactive conformation incapable of effector binding. To address the biochemical properties of state 1, we measured the P-31 NMR spectra of five Ras family small GTPases; H-Ras, M-Ras, Rap1A, Rap2A and Ra1A, and find that they exhibit distinctive state 2/state 1 populations with the ratios ranging from 0.072 for M-Ras to 16 for Rap2A. Further, we show that GTPases with higher populations of state I exhibit higher dissociation and association rate constants for GTP. These results imply that GTP loading to the nucleotide-free small GTPases preferentially yields state 1, which is subsequently converted to state 2, rendering the GTP-bound form functional. (c) 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.ACADEMIC PRESS INC ELSEVIER SCIENCE, 2008年05月, BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, 369(2) (2), 327 - 332, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Activity improvement of an antimicrobial peptide, thanatin, has been achieved up to 4-fold higher than natural original one by site-specific chemical modifications with tert-butyl group at two cysteine residues which form an intramoleular disulfide bridge. The chemically modified thanatin (C11tBu/C18tBu) exhibited improved antimicrobial activity toward Gram-positive bacteria, Micrococcus luteus, whereas lowered activity toward Gram-negative bacteria, Escherichia coli. This finding suggests that disulfide-bridge formation is not only indispensable for exhibition of antimicrobial activity of thanatin but also closely related to the activity specificity towards bacteria. NMR analysis indicates that thanatin acts against Ecoli stereospecifically by taking advantage of its C-terminal beta-hairpin structure, while the activity against M. luteus does not relate to structures and correlates very well to side-chain hydrophobicity. (c) 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.ACADEMIC PRESS INC ELSEVIER SCIENCE, 2008年05月, BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, 369(2) (2), 609 - 615, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2008年, 生物物理, 48, S133, 英語
- Two structural changes of poly-L-lysine have been studied by various spectroscopic techniques; one is a structural change of a random coil sample in solution to a mixture of alpha-helix and beta-sheet during rapid freezing in the lyophilizing process, and the other is a pressure-induced structural change from an alpha-helix to a beta-sheet structure for a lyophilized sample.ROYAL SOC CHEMISTRY, 2008年, PHYSICAL CHEMISTRY CHEMICAL PHYSICS, 10(33) (33), 5042 - 5044, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Intrinsic rules of determining the tertiary structure of a protein have been unknown partly because physicochemical factors that contribute to stabilization of a protein structure cannot be represented as a linear combination of local interactions. To clarify the rules on the nonlinear term caused by nonlocal interaction in a protein, we tried to transform a peptide that has a fully helical structure (Target Peptide or TP) into a peptide that has a P-hairpin structure (Designed Peptide or DP) by adding seven residues to the C terminus of TP. According to analyses of nuclear magnetic resonance measurements, while the P-hairpin structure is stabilized in some DPs, it is evident that the helical structure observed in TP is also persistent and even extended throughout the length of the molecule. As a result, we have produced a peptide molecule that contains both the a-helix and P-hairpin conformation at an almost equally populated level. The helical structures contained in these DPs were more stable than the helix in TP, suggesting that stabilizing one conformation does not result in destabilizing the other conformation. These DPs can thus be regarded as an isolated peptide version of the chameleon sequence, which has the capability of changing the secondary structure depending on the context of the surrounding environment in a protein structure. The fact that the transformation of one secondary structure caused stabilization of both the original and the induced structure would shed light on the mechanism of protein folding.WILEY-LISS, 2007年03月, PROTEINS-STRUCTURE FUNCTION AND BIOINFORMATICS, 66(4) (4), 860 - 868, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2007年, 生物物理, 47, S206, 英語
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2007年, 生物物理, 47, S209, 英語
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2007年, 生物物理, 47, S29, 英語
- We investigated the reactivity of heme-coordinating imidazole with diethylpyrocarbonate using a soluble domain of cytochrome b(5). Analyses with various spectroscopic methods including MALDI-TOF-MS indicated that two axial His residues (His44 and His68) of cytochrome b(5) were protected from the modification by several factors, i.e., limited steric exposure of the axial imidazole to the solvent, the Fe-N-epsilon 2 coordination bond, and protonation of the N delta(1) position by forming a hydrogen bond with its immediate surroundings. However, once N-carbethoxylation at the N-epsilon 2 position of the axial His residues occurred with a higher concentration of diethylpyrocarbonate, displacement of heme prosthetic group from the protein moiety continued. Simultaneously, it facilitated the second N-carbethoxylation to take place at the N-epsilon 1 position of the same imidazole ring, leading to a bis-N-carbethoxylated derivative and further to a ring-opened derivative. A similar mechanism seemed in operation for one non-axial His residue (His85), in which the N-delta 1 atom works as a hydrogen acceptor in a strong hydrogen-bond and the other N-epsilon 2 atom is in a protonated form, resulting in a formation of the ring-opened derivative upon treatment with a higher concentration of diethylpyrocarbonate. These results suggested that the use of diethylpyrocarbonate for MALDI-TOF-MS analysis might provide a unique method to characterize the protonation state of His residues and the strength of their hydrogen-bondings at the active site of enzymes.JAPANESE BIOCHEMICAL SOC, 2006年10月, JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 140(4) (4), 561 - 571, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Frequency-dependent absorption coefficients and refractive indices of amino acids ( glycine and L-alanine) and polypeptides ( polyglycine and poly-L-alanine) in the wavenumber region from 7 to 55 cm(-1) were measured by terahertz time-domain spectroscopy. A vibrational band was observed at 45.5 cm(-1) for polyglycine, which was assigned as an interchain mode. The reduced absorption cross sections of the amino acids and polypeptides show power-law behavior. The exponents are different between the monomers and polymers, and those of the two polypeptides suggest that the time dependences of the total dipole moments are similar in the timescale of subpico- to picoseconds.BIOPHYSICAL SOCIETY, 2005年09月, BIOPHYSICAL JOURNAL, 89(3) (3), L22 - L24, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Although some members of Ras family small GTPases, including M-Ras, share the primary structure of their effector regions with Ras, they exhibit vastly different binding properties to Ras effectors such as c-Raf-1. We have solved the crystal structure of M-Ras in the GDP-bound and guanosine 5'-(beta, gamma-imido) triphosphate (Gpp(NH) p)-bound forms. The overall structure of M-Ras resembles those of H-Ras and Rap2A, except that M-Ras-Gpp( NH) p exhibits a distinctive switch I conformation, which is caused by impaired intramolecular interactions between Thr-45 (corresponding to Thr-35 of H-Ras) of the effector region and the gamma-phosphate of Gpp(NH) p. Previous P-31 NMR studies showed that H-Ras-Gpp( NH) p exists in two interconverting conformations, states 1 and 2. Whereas state 2 is a predominant form of H-Ras and corresponds to the "on" conformation found in the complex with effectors, state 1 is thought to represent the "off" conformation, whose tertiary structure remains unknown. P-31 NMR analysis shows that free M-Ras-Gpp(NH)p predominantly assumes the state 1 conformation, which undergoes conformational transition to state 2 upon association with c-Raf-1. These results indicate that the solved structure of M-Ras-Gpp(NH) p corresponds to the state 1 conformation. The predominance of state 1 in M-Ras is likely to account for its weak binding ability to the Ras effectors, suggesting the importance of the tertiary structure factor in small GTPase-effector interaction. Further, the first determination of the state 1 structure provides a molecular basis for developing novel anti-cancer drugs as compounds that hold Ras in the state 1 "off" conformation.AMER SOC BIOCHEMISTRY MOLECULAR BIOLOGY INC, 2005年09月, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 280(35) (35), 31267 - 31275, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Huntington's disease is a progressive neurodegenerative disorder caused by a polyglutamine repeat expansion in the first exon of the huntingtin (Htt) protein. N-terminal Htt peptides with polyglutamine tracts in the pathological range (51-122 glutamines) form high-molecular-weight protein aggregates with fibrillar morphology in vitro, and they form discrete inclusion bodies in a cell-culture model. However, in some studies, formation of discrete Htt inclusions does not correlate well with cell death. We coexpressed N-terminal Htt fragments containing 91 glutamines fused to different affinity tags in HEK293 cells, and we isolated small aggregates by double sequential-affinity chromatography to assure the isolation of multimeric molecules. Transmission electron microscopy and atomic force microscopy revealed the isolated aggregates as globules or clusters of globules 4-50nm in diameter without any detectable fibrillar species. Because small nonfibrillar oligomers, not mature fibrils, recently have been suggested to be the principal cytotoxic species in neurodegenerative disease, these Htt globular aggregates formed in cells may represent the pathogenic form of mutant Htt.NATL ACAD SCIENCES, 2005年08月, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 102(31) (31), 10887 - 10892, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Many simple, sin.-le-domain proteins fold via first order kinetics, indicative of a single, dominant free energy barrier. Because folding usually involves the burial of hydrophobic side chains, the acquisition of native structure may be associated with a decrease in the heat capacity of the system. If the transition state ensemble involves the burial of hydrophobic residues, the folding rates show a well-known concave downward dependence on temperature, exhibiting a maximum folding rate with respect to temperature. Within the framework of transition state theory, the maximum folding rate for a specific native structure depends simply on the entropic barrier as well as the heat capacity of activation. The latter is related to the mean hydrophobicity when the protein is largely unfrustrated with regard to its stabilizing interactions. As an example, here we show that the maximum folding rate of the three-helix bundle structure of 1prb7-53, the GA module of an albumin binding domain, can indeed be fine-tuned using computational, methods to identify and design structurally consistent mutations that modulate its hydrophobic content. Specifically, we find design that the logarithm of the maximal folding rate depends linearly on the mean hydrophobic content of the designed sequences, where faster folding correlates with higher mean hydrophobicity. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE BV, 2004年12月, CHEMICAL PHYSICS, 307(2-3) (2-3), 99 - 109, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The kinetics of the folding of a small protein, POIA1, and its two variants lacking proline residues, has been investigated by using stopped-flow measurements. Although all these proteins fold and unfold in a two-state manner, logarithms of the observed rate constants display a curvilinear dependence against denaturant concentration. Two possible mechanisms that can explain these phenomena are proposed. One is the two-state model with moving transition, which shows that the energy surface depicted from these curved chevron plots for each protein is broad and the transition state moves toward the native state with increasing concentration of the denaturant on the reaction coordinate. The shift in the transition state either increases or decreases depending on the mutation sites, reflecting changes in the high-energy structures. The other is the three-state model with a high-energy intermediate state, in which relative energies for the two transition states vary depending on the denaturant concentrations and mutation sites. Comparison of these two models sheds light on underlying differences in the folding mechanisms for these proteins. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE BV, 2004年12月, Chemical Physics, 307(2-3) (2-3), 233 - 242, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- We have determined the key regions for protein foldability by creating multiple crossover libraries from two proteins that share similar fold but have low sequence identity and differ significantly in stability. One protein is the propeptide of a serine protease, subtilisin BPN', and the other is Pleurotus ostreatus proteinase A inhibitor 1 (POIA1). The propeptide has a compact structure when complexed with subtilisin but is unstructured when isolated, whereas POIA1 takes a stable structure. We selected four of the conserved amino acid residues for the boundaries of crossover sites and utilized these residues to make same cohesive-ends to assemble synthetic DNA fragments. Each segment has one or two secondary structure units, and the interchange of these structural elements produces 32 (= 2(5)) combinations, including the propeptide and POIA1. The stability of these mutants was first screened by formation of turbid zones on skim milk plates containing subtilisin BPN'. It was shown that six variants were foldable and structural units necessary for folding were identified. Further fragmentation and recombination of these mutants (the "multisection" method) revealed that two interactions between secondary structures are important; one is interaction between the loop-alpha1 and beta2-turn-beta3, and the other is hydrophobic interaction between the adjoining beta1 and beta4 strands. We were also able to specify the significant amino acid combinations for tolerance to proteolysis. These combinatorial methods not only elucidate how domains can be interchanged to make the whole protein foldable but also extract essential regions for the function, which is correlated with the instability of the molecule.AMER CHEMICAL SOC, 2004年06月, BIOCHEMISTRY, 43(21) (21), 6596 - 6605, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2004年, 生物物理, 44, S131, 日本語
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2004年, 生物物理, 44, S217, 日本語
- Fibrillar aggregates observed in vivo and in vitro are part of "abnormal" structures of proteins. Since many proteins are capable of forming such fibrillar aggregates that share characteristics of the cross-β structure at an atomic level, we consider the fibril structure as one of general states of proteins. It is thus profoundly important to reveal the fibril structure and mechanism of its formation. To this end, mass spectrometry is used as an essential tool by making full use of the inherent sensitivity and high information content. Especially, combination of proteolysis and mass spectrometry is a powerful technique to characterize structural features of the aggregated state of proteins. By identifying fragments produced in the course of proteolysis, it is possible to discern differences in local stability within the analyzed protein and to reconstruct the structure of the mature fibril. In this review, we explain several useful methods to characterize fibrillar aggregates by the combined use of proteolysis and mass spectrometry.The Mass Spectrometry Society of Japan, 2004年, J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., 52(3) (3), 102 - 105, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- De novo sequence design of foldable proteins provides a way of investigating principles of protein architecture. We performed fully automated sequence design for a target structure having a three-helix bundle topology and synthesized the designed sequences. Our design principle is different from the conventional approach, in that instead of optimizing interactions within the target structure, we design the global shape of the protein folding funnel. This includes automated implementation of negative design by explicitly requiring higher free energy of the denatured state. The designed sequences do not have significant similarity to those of any natural proteins. The NMR and CID spectroscopic data indicated that one designed sequence has a well-defined three-dimensional structure as well as alpha-helical content consistent with the target.CELL PRESS, 2003年05月, STRUCTURE, 11(5) (5), 581 - 590, 英語研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2003年, 生物物理, 43, S77, 日本語
- Outer surface protein A (OspA) from Borrelia burgdorferi is a predominantly beta-sheet protein comprised of beta-strands beta1 - beta21 and a short C-terminal alpha-helix. It contains two globular domains (N and C-terminal domains) and a unique single-layer beta-sheet (central P-sheet) that connects the two domains. OspA contains an unusually large number of charged, amino acid residues. To understand the mechanism of stabilization of this unique beta-sheet protein, thorough thermodynamic investigations of, OspA and its truncated mutant lacking a part of the C-terminal domain were conducted using calorimetry and circular dichroism. The stability of OspA was found to be sensitive to pH and salt concentration. The heat capacity curve clearly consisted of two components, and all the thermodynamic parameters were obtained for each step. The thermodynamic parameters associated with the two transitions are consistent with a previously proposed model, in which the first transition corresponds to the unfolding of the C-terminal domain and the last two beta-strands of the central beta-sheet, and the second transition corresponds to that of the N-terminal domain and the first beta-strand of the central beta-sheet in the second peak. The ratio of calorimetric and van't Hoff enthalpies indicates that the first peak includes another thermodynamic intermediate state. Large heat capacity changes were observed for both transitions, indicative of large changes in the exposure of hydrophobic surfaces associated with the transitions. This observation demonstrates that hydrophobic parts are buried efficiently in the native structure in spite of the low content of hydrophobic residues in OspA. By decomposing the enthalpy, entropy, and Gibbs free energy into contributions from different interactions, we found that the enthalpy changes for hydrogen bonding and polar interactions are exceptionally large, indicating that OspA maintains its stability by making full use of its unique beta-sheet and high content of polar residues. These thermodynamic analyses demonstrated that it is possible to maintain protein tertiary structure by making effective use of an unusual amino acid composition. (C) 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.ACADEMIC PRESS LTD ELSEVIER SCIENCE LTD, 2002年11月, J. Mol. Biol., 323(4) (4), 751 - 762, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Pulsed terahertz (THz) radiation and black-body radiation are applied to measure far infrared (FIR) absorption spectra of polypeptides and cytochrome c in the wavenumber region from 7 cm(-1) to 160 cm(-1). In the region from 7 cm(-1) to 55 cm(-1), FIR absorption cross sections of polyglycine and poly-L-alanine in powder are greater than those of glycine and L-alanine in powder. On the other hand, FIR absorption spectra of cytochrome c in lyophilized powder show little dependence on protein structures. The structures of biopolymers are investigated by mid-IR absorption (polypeptides and cytochrome c) and by resonance Raman scattering (cytochrome c). FIR spectral features of biopolymers in the THz frequency region are qualitatively discussed in terms of density of states and homogeneous/inhomogeneous broadening.CHEMICAL SOC JAPAN, 2002年05月, BULLETIN OF THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN, 75(5) (5), 1083 - 1092, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Solution structure of POIA1 (Pleurotus ostreatus proteinase A inhibitor 1), which functions as an intramolecular chaperone and as an inhibitor to subtilisin, was determined. By making use of the fact that POIA1 is the only structured protein that shows homology to the propeptide of subtilisin, which is unstructured by itself, foldability of this protein was elucidated. It became clear that the evolutionarily conserved residues play two important roles, one for the maintenance of its own structure, and the other for the interaction with subtilisin. Structural softness and mutational tolerance contained in the POIA1 structure makes it an ideal material for designing a foldable protein. (C) 2002 Elsevier Science Ltd.ACADEMIC PRESS LTD ELSEVIER SCIENCE LTD, 2002年03月, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 317(1) (1), 159 - 167, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2002年, 生物物理, 42(2) (2), S69, 日本語
- Borrelia outer surface protein A (OspA) contains a unique single-layer P-sheet that connects N and C-terminal globular domains. This singlelayer beta -sheet segment (beta -strands 8-10) is highly stable in solution, although it is exposed to Me solvent on both faces of the sheet and thus it does not contain a hydrophobic core. Here, we tested whether interactions with the C-terminal domain are essential for the formation of the single-layer P-sheet. We characterized the solution structure, dynamics and stability of an OspA fragment corresponding to P-strands 1-12 (termed OspA[27-163]), which lacks a majority of the C-terminal globular domain. Analyses of NMR chemical shifts and backbone nuclear Overhauser effect (NOE) connectivities showed that OspA[27-163] is folded except the 12th and final beta -strand. H-1-N-15 heteronuclear NOE measurements and amide H-H-2 exchange revealed that the single-layer beta -sheet in this fragment is more flexible than the corresponding region in full-length OspA. Thermal-denaturation experiments using differential scanning calorimetry and NMR spectroscopy revealed that the N-terminal globular domain in the fragment has a conformational stability similar to that of the same region in the full-length protein, and that the single-layer beta -sheet region also has a modest thermal stability. These results demonstrate that the unique single-layer beta -sheet retains its conformation in the absence of its interactions with the C-terminal domain. This fragment is significantly smaller than the full-length OspA, and thus it is expected to facilitate studies of the folding mechanism of this unusual beta -sheet structure. (C) 2001 Academic Press.ACADEMIC PRESS LTD, 2001年04月, J. Mol. Biol., 308(2) (2), 367 - 375, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2001年, 生物物理, 41, S46, 日本語
- Terahertz radiation was applied to measurements of far infrared absorption spectra of polypeptides of glycine and L-alanine and cytochrome c in the native and denatured states to investigate collective modes in biopolymers.IEEE, 2001年, CLEO(R)/PACIFIC RIM 2001, VOL II, TECHNICAL DIGEST, 200 - 201, 英語研究論文（国際会議プロシーディングス）
- Secondary structures and structural fluctuation in a dimeric protein, Streptomyces subtilisin inhibitorBased on the nuclear magnetic resonance assignments of a dimeric protein, Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI), microscopic details of secondary structures in solution have been elucidated. The chemical shift index of C-alpha signals, together with information on the hydrogen exchange rates of the backbone amide protons, were used to identify secondary structures. The locations of these secondary structures were found to be different in some critical points from those determined earlier by X-ray crystallography of the crystal. Notably, the beta 3 strand is completely missing and the alpha 2 helix is extended toward the C-terminus. Furthermore, hydrogen exchange experiments of individual peptide NH protons under strongly folding conditions revealed mechanisms of global and local structural fluctuation within the dimeric structure. It has been suggested that the global fluctuation of the monomeric unit occurs without affecting the accompanying monomer, in contrast to the equilibrium thermal unfolding, which is cooperative, Higher protection against hydrogen exchange for residues in part of the beta 4 strand implies that this region might serve as a folding core.JAPANESE BIOCHEMICAL SOC, 1999年11月, JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 126(5) (5), 859 - 865, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- KLUWER ACADEMIC PUBL, 1999年07月, JOURNAL OF BIOMOLECULAR NMR, 14(3) (3), 285 - 286, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Outer surface protein A (OspA) from the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, is a dumbbell-shaped protein in which two globular domains are connected by a three-stranded beta-sheet segment that is solvent-exposed on both faces. Previous studies showed that the whole protein, including the single-layer beta-sheet, is highly rigid. To elucidate the folding mechanism and the role of the central beta-sheet in the formation of the rigid molecule, we investigated the equilibrium thermal denaturation reaction of OspA. We applied differential scanning calorimetry, heteronuclear NMR spectroscopy, and solution small-angle X-ray scattering (SAXS) to characterize the reaction in detail. All three techniques revealed that OspA denatures in two separable cooperative transitions. NMR measurements on OspA specifically N-15- labeled at Lys residues identified the locations of the two folding units and revealed that the C-terminal segment is less stable than the remaining N-terminal segment. The boundary between the two folding units is located within the central beta-sheet. The interconversion among the three folding states (fully folded, C-terminus unfolded, and fully denatured) is slow relative to chemical shift differences (<24 Hz), indicating that there are significant kinetic barriers in the denaturation reactions. SAXS measurements determined the radius of gyration of the native protein to be 25.0 +/- 0.3 Angstrom, which increases to 34.4 +/- 1.0 Angstrom in the first transition, and then to 56.1 +/- 1.6 Angstrom in the second transition. Thus, the intermediate state, in which the C-terminal folding unit is already denatured, is still compact. These results provide a basis for elucidating the folding mechanism of OspA.AMER CHEMICAL SOC, 1999年04月, Biochemistry, 38(15) (15), 4757 - 4767, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 1999年, 生物物理, 39, S103, 日本語
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 1999年, 生物物理, 39, S163, 日本語
- Effects of mutations of a protein, Streptomyces subtilisin inhibitor, on cold denaturation have been examined by means of differential scanning calorimetry. Cold denaturation was observed in a mutation-independent manner, while heat denaturation was clearly dependent on the mutations, suggesting that hydration of polar peptide bonds are responsible for the transition of a protein structure at low temperature. The hydration effect was also examined by extrapolating thermodynamic data previously obtained for amino acid replacements at Met73, which is completely exposed to solvent. Enthalpic changes induced by the mutations were shown to be nearly compensated by the entropic changes at 25 degrees C, whereas the deviation became larger at 100 degrees C, suggesting that the hydration is a primary cause for the compensation. (C) 1998 Elsevier Science B.V.ELSEVIER SCIENCE BV, 1998年01月, THERMOCHIMICA ACTA, 308(1-2) (1-2), 35 - 40, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The temperature induced unfolding/dissociation of the dimeric subtilisin inhibitor from Streptomyces and its mutant D83C having an S-S crosslink between the subunits has been studied calorimetrically. Comparison of the entropies measured at different concentrations of dimer showed that the entropy cost of crosslinking is small. Its value at the standard concentration of 1 M is of the order of -(5 +/- 4) cal/K-mol, i.e. it is more than one order of magnitude smaller than the values of translational entropies calculated on the base of statistical thermodynamics, using in particular the Sackur-Tetrode equation, and is close to the cratic entropy value suggested by classical mixing theory. (C) 1997 Academic Press Limited.ACADEMIC PRESS LTD, 1997年11月, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 273(5) (5), 1048 - 1060, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Dynamics of the three methionyl side chains of Streptomyces subtilisin inhibitor. Deuterium NMR studies in solution and in the solid stateStreptomyces subtilisin inhibitor (SSI) contains three methionine residues in a subunit: two (at positions 73 and 70) in the crucial enzyme-recognition sites P1 and P4, respectively, and one (Met 103) in the hydrophobic core. The motions of the side chains of these three Met residues and the changes in mobility on binding with subtilisin were studied by deuterium NMR spectroscopy in solution and in crystalline and powder solids. For this purpose, the wild-type SSI was deuterium-labeled at the methyl groups of all three Met residues, and three artificial mutant proteins were labeled at only one specific Met methyl group each. In solution, for methionines 73 and 70, the effective correlation times were only 0.8-1.0 x 10(-10) s indicating that the two side chains on the surface fluctuate almost freely. On formation of a complex with subtilisin, however, these high mobilities were quenched, giving a correlation time of 1.1 x 10(-8) s for the side chains of methionines 70 and 73. The correlation time of Met 103, located in the hydrophobic core, was at least 1.0 x 10(-8) s in free SSI, showing that its side chain motion is highly restricted. The nature of the internal motions of the three Met side chains was examined in more detail by deuterium NMR spectroscopy of powder and crystalline samples. The spectral patterns of the powder samples depended critically on hydration: immediately after lyophilization, the side-chain motions of the three Met residues were nearly quenched. With gradual hydration to 0.20 gram of water per gram protein-water, the orientational fluctuation of the methyl axes of methionines 70 and 73 was selectively enhanced in both amplitude and frequency (to about 1 MHz) and, at nearly saturating hydration (0.60 gram of water per gram protein-water), became extremely high in amplitude and frequency (>10 MHz). In contrast, the polycrystalline wild-type SSI spectrum showed fine structures, reflecting characteristic motions of the Met side chains. The polycrystalline spectrum could be reproduced reasonably well by the same motion models and parameters used to simulate the powder spectrum at the final level of hydration, suggesting that the side-chain motions are similar in the fully hydrated powder and in crystals. Spin-lattice relaxation measurements gave evidence that, even in crystals, the methyl axes of all three Met residues undergo rapid motions with correlation times between 10(-8) and 10(-10) s, comparable to the correlation times in solution. Finally, in the hydrated stoichiometric complex of SSI with subtilisin BPN' in the solid state, large-amplitude motions are absent, but the side chains of methionines 70 and/or 73 are likely to have small-amplitude motions.CAMBRIDGE UNIV PRESS, 1996年01月, PROTEIN SCIENCE, 5(1) (1), 127 - 139, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Amino acid replacements in a homodimeric protein, Streptomyces subtilisin inhibitor, at the position of Val13, which is located at the center of the β-sheet interface of the domain-domain interaction, changed both the overall stability and the denaturational scheme. All the mutant forms lost stability, losses in free energy at 82.21°C at pH 7.0 obtained by calorimetric measurements ranging from 10.3 kcal (mol dimer)-1 for the Gly mutant, which involved a loss in enthalpy without a compensating loss in entropy to 0.84 kcal (mol dimer)-1 for the Ile mutant, which involved comparable losses in enthalpy and entropy. A gain in enthalpy for the Ala mutant was overcome by a gain in entropy, resulting in a loss in free energy by 6.78 kcal (mol dimer)−1. It was found that decreases in enthalpy and entropy showed good correlation with increasing side-chain hydrophobicity, while no such correlation was present for free energy. Replacements with Gly, Ala, Met and Phe altered the thermal denaturational scheme from N2 ⇌ 2D which was the case for the Leu and Ile mutants as well as for the wild-type, to N2 ⇌ 2N ⇌ 2D, where the first step call be regarded as a dissociation of the native dimer followed by a major unfolding in the second step. The free energy acquired by forming the dimer was estimated to be 2.03 kcal mol−1 for the Ala mutant at 66.95°C at pH 9.5 and lower for the other three mutants. © 1995 Academic Press Limited.1995年06月, Journal of Molecular Biology, 249(3) (3), 636 - 645, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- A THERMODYNAMIC STUDY OF MUTANT FORMS OF STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITOR .3. REPLACEMENTS OF A HYPER-EXPOSED RESIDUE, MET73Amino acid replacements of Met73, which is hyper-exposed in the native structure, with Asp, Glu, Lys, Gly, Ala, Val, Leu or Ile changed the stability of Streptomyces subtilisin inhibitor by +1.60 to -0.94 kcal/mol(-1) in free energy at 82.21 degrees C at pH 7.0, with higher hydrophobicity of the replacing amino acid side-chain showing a correlation with lower stability Thermodynamic parameters obtained from detailed calorimetric analyses gave a nearly proportional relation between the entropy change and the enthalpy change of denaturation, i.e. T Delta Delta S degrees = -0.03 (+/-0.11) + 1.14 (+/-0.03) Delta Delta H, with the linear correlation coefficient 0.996 for 18 data points. This proportionality observed uniquely for the substitutions at position 73 was caused primarily by the water/side-chain interaction, or hydration effect, which can account for the majority of the changes in enthalpy and entropy induced by the mutations.ACADEMIC PRESS (LONDON) LTD, 1995年06月, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 249(3) (3), 646 - 653, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- A THERMODYNAMIC STUDY OF MUTANT FORMS OF STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITOR .1. HYDROPHOBIC REPLACEMENTS AT THE POSITION OF METL03The thermodynamic effects of replacing the Met residue at amino acid position 103 of Streptomyces subtilisin inhibitor with other non-polar aliphatic residues were studied by means of differential scanning calorimetry All but the Leu mutant, which is as stable as the wild-type but has different cooperative units in the course of unfolding, showed destabilization in terms of free energy Similar losses in free energy, however, were caused by different reasons, i.e. by increased entropy for the Ala mutant and by decreased enthalpy for the Ile mutant, with a tendency that increases in entropy are accompanied by increases in enthalpy. The gain in entropy that caused the largest loss in free energy for the Gly mutant was unexpectedly smaller than that for the Ala mutant. The changes in enthalpy and entropy induced by the mutations exhibited some correlations with hydrophobicity, while no clear correlation was found between the changes in free energy and hydrophobicity.ACADEMIC PRESS (LONDON) LTD, 1995年06月, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 249(3) (3), 625 - 635, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- A THERMODYNAMIC STUDY OF MUTANT FORMS OF STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITOR .2. REPLACEMENTS AT THE INTERFACE OF DIMER FORMATION, VAL13Amino acid replacements in a homodimeric protein, Streptomyces subtilisin inhibitor, at the position of Val13, which is located at the center of the beta-sheet interface of the domain-domain interaction, changed both the overall stability and the denaturational scheme. All the mutant forms lost stability, losses in free energy at 82.21 degrees C at pH 7.0 obtained by calorimetric measurements ranging from 10.3 kcal (mol dimer)(-1) for the Gly mutant, which involved a loss in enthalpy without a compensating loss in entropy, to 0.84 kcal (mol dimer)(-1) for the lie mutant, which involved comparable losses in enthalpy and entropy A gain in enthalpy for the Ala mutant was overcome by a gain in entropy, resulting in a loss in free energy by 6.78 kcal (mel dimer)(-1). It was found that decreases in enthalpy and entropy showed good correlation with increasing side-chain hydrophobicity, while no such correlation was present for free energy Replacements with Gly, Ala, Met and Phe altered the thermal denaturational scheme from N-2 reversible arrow 2D, which was the case for the Leu and Ile mutants as well as for the wild-type, to N-2 reversible arrow 2N(.) reversible arrow 2D, where the first step can be regarded as a dissociation of the native dimer followed by a major unfolding in the second step. The free energy acquired by forming the dimer was estimated to be 2.03 kcal mol(-1) for the Ala mutant at 66.95 degrees C at pH 9.5 and lower for the other three mutants.ACADEMIC PRESS (LONDON) LTD, 1995年06月, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 249(3) (3), 636 - 645, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- In this paper we show that the usual assumption in studies of the temperature variation of equilibrium constants for equilibria of the form A + B reversible arrow AB that a plot of In K vs. 1/T (K = equilibrium constant, T = temperature in degrees kelvin) is a straight line with slope equal to -Delta H-vH/R (Delta H-vH = van't Hoff or apparent enthalpy, R = gas constant) is not valid in many cases, In all the cases considered here, Delta H-vH is temperature dependent and is significantly different from the true or calorimetrically measured enthalpy, and the respective values for Delta C-p are also significantly different.NATL ACAD SCIENCES, 1995年06月, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 92(12) (12), 5597 - 5599, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 1995年, 熱測定, 22, 186 - 189, 日本語タンパク質低温変性の熱力学[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- It has been known that proteins can be denatured not only by increasing the temperature but also by decreasing it. The latter phenomenon, which is normally called "cold denaturation", shows common features of protein unfolding as well as characteristics that are specific to each protein.一般社団法人日本生物物理学会, 1995年, 生物物理, 35(1) (1), 40 - 43, 日本語[査読有り][招待有り]研究論文（学術雑誌）
- EFFECT OF AN INTERSUBUNIT DISULFIDE BOND ON THE STABILITY OF STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITORThe effect of an engineered disulfide bond between two identical subunits of a dimeric protein, Streptomyces subtilisin inhibitor, on the stability of the protein was studied by differential scanning calorimetry. The introduction of the linkage caused a large stabilization without changing the cooperativity of unfolding, with the denaturation temperature of a 2 mg/mL solution being increased by 14.3 degrees C to 95.0 degrees C at pH 9.5 and by 16.4 degrees C to 63.0 degrees C at pH 3.0. The stabilization was caused by a loss of denaturational entropy, i.e., -40 and -98 cal K-1 mol(-1) at pH 3.0 and 9.5, respectively, which more than compensated for the loss in the denaturational enthalpy.AMER CHEMICAL SOC, 1994年12月, BIOCHEMISTRY, 33(48) (48), 14512 - 14520, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- QUANTITATIVE-EVALUATION OF WATER-CONTENT IN A SOLID PROTEIN BY DEUTERIUM NMRA method for evaluating absolute water content in a solid protein based on deuterium NMR measurements in solution is described. By dissolving the hydrated solid protein, which has been specifically deuterium-labeled, into deuterium-depleted water and by comparing the deuterium NMR signal intensity of water ((HHO)-H-1-H-2) with that of the protein, the amount of water contained in the solid protein is evaluated quantitatively. The method requires a heat pretreatment of the protein sample in water of an enriched (e.g. 2%) deuterium composition for complete hydrogen exchange of the labile protons, and hence is applicable to a protein with a reasonably good reversibility of thermal unfolding. By utilizing this method, the absolute content of the bound water in a protein, Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI), lyophilized for 8 h was determined to be 9.2%. The extent of hydration of solid SSI during its exposure to a deuterium-enriched water vapor could also be followed from the deuterium NMR signals in solution. In addition, solid state deuterium NMR measurements of SSI suggested that direct measurement of the natural abundance deuterium signal can give a reasonable estimate of the water content in a solid protein.ELSEVIER SCIENCE BV, 1992年02月, BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, 1119(2) (2), 178 - 184, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- STRUCTURE OF THE ACTIVE 27-RESIDUE FRAGMENT OF HUMAN CALPASTATINA synthetic 27-residue peptide corresponding to exon 1B of the endogenous inhibitor calpastatin contains a well-conserved region and has an ability to inhibit the cysteine endopeptidase calpain specifically. We examined the solution structure of this peptide in DMSO-d6 by two-dimensional H-1 NMR spectroscopy. Although regular secondary structures such as alpha-helix and beta-sheet were not found, the region from Ile18 to Arg23 formed a well-defined structure with a type I beta-turn. This region coincided well with the highly conserved region of calpastatin. The result strongly suggests that this turn structure is essential for the inhibitory activity of calpastatin.ELSEVIER SCIENCE BV, 1991年12月, FEBS LETTERS, 294(1-2) (1-2), 64 - 66, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- COLD DENATURATION AND HEAT DENATURATION OF STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITOR .2. H-1-NMR STUDIESStructural transitions of the protein Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) from the native state to the cold-denatured and heat-denatured states were studied by H-1 NMR spectroscopy in the temperature range from -10 to 60-degrees-C in the acidic pH range. Assignments of some of the H-1 NMR signals of SSI in the cold-denatured and heat-denatured states were performed by a combined use of selective deuteration and site-directed mutagenesis. Throughout the pH range from 2.1 to 3.1, both transitions were cooperative and basically only three distinct spectra corresponding to structures in the cold-denatured, native, and heat-denatured states were detected. In the cold-denatured state, the side-chain signals of Met73, His106, at least one Val, and two Leu were observed at distinctly shifted positions from those for a random-coiled structure, suggesting the formation of a tertiary structure, while those of Met70, His43, and Ala2 were observed at positions for a random-coiled structure. This tertiary structure in the cold-denatured state is entirely different from that in the native state, as some amino acid residues exposed to the solvent in the native state (e.g., Met73, His106) are buried while those sequestered in the native state (e.g., His43) are exposed. In the heat-denatured state, however, most H-1 NMR signals were observed at random-coiled positions, indicating that there is much less tertiary structure in the heat-denatured state than in the cold-denatured state. At pH values below 2.09, a structural transition was observed from the cold-denatured state to the heat-denatured state without passing through the native state. A sedimentation equilibrium experiment indicated that the two subunits of SSI were dissociated in both the heat-denatured and cold-denatured states, eliminating the possibility of formation of a tertiary structure in the cold-denatured state by intersubunit interaction, such as by aggregation.AMER CHEMICAL SOC, 1991年11月, BIOCHEMISTRY, 30(47) (47), 11313 - 11320, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- COLD DENATURATION AND HEAT DENATURATION OF STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITOR .1. CD AND DSC STUDIESCold denaturation and heat denaturation of the protein Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) were studied in the pH range 1.84-3.21 and in the temperature range -3-70-degrees-C by circular dichroism and scanning microcalorimetry. The native structure of the protein was apparently most stabilized at about 20-degrees-C and was denatured upon heating and cooling from this temperature. Each denaturation was reversible and cooperative, proceeding in two-state transitions, that is, from the native state to the cold-denatured state or from the native state to the heat-denatured state. The two denatured states, however, were not perfect random-coiled structures, and they differed from each other, indicating that there exist three states in this temperature range, i.e., cold denatured, native, and heat denatured. The difference between the cold and heat denaturations was indicated first by circular dichroism. The isodichroic point for the transition from the native state to the cold-denatured state was different from that from the native state to the heat-denatured state in the pH range between 3.21 and 2.45. Moreover, molar ellipticity for the cold-denatured state was different from that of the heat-denatured state, and the transition from the former to the latter was observed at pH values below 2. Values of van't Hoff enthalpies from the native state to the heat-denatured state at pH values between 3.21 and 2.45 were obtained by curve fitting of the CD data, and DELTA-C(p) = 1.82 (+/- 0.11) [kcal/(mol.K)] was obtained from the linear plot of the enthalpies against temperature. The parameters obtained from the heat denaturation studies gave curves for DELTA-G-degrees which were not in agreement with the experimental data in the cold denaturation region when extrapolated to the low temperature. Moreover, the value of the apparent DELTA-C(p) the cold denaturation in the pH range 3.03-2.45 was estimated to be different from that for the heat denaturation, indicating that the mechanism of the cold denaturation of SSI is different from a simple cold denaturation. A differential scanning calorimetric study confirmed that the heat denaturation was of the cooperative two-state type (from the dimeric form in the native state to the monomeric form in the heat-denatured state) with absorption of enthalpy upon increasing the temperature at pH 3.07. As the pH decreased, however, the enthalpy for the heat denaturation decreased whereas that for the cold denaturation showed a different behavior. The value of the heat capacity of the protein in the cold-denatured state is different from that in the heat-denatured state and is even closer to that in the native state. Furthermore, below pH 2, a direct transition between the two denatured states was observed with absorption of heat.AMER CHEMICAL SOC, 1991年11月, BIOCHEMISTRY, 30(47) (47), 11307 - 11313, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- MECHANISMS OF TEMPORARY INHIBITION IN STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITOR INDUCED BY AN AMINO-ACID SUBSTITUTION, TRYPTOPHAN-86 REPLACED BY HISTIDINEJust one amino acid substitution (Trp86 replaced by His), which is more than 30 angstrom away from the reactive site, changed the inhibitor, Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI), into a temporary inhibitor without a change in the inhibition constant. When the inhibitor was in excess of subtilisin BPN', the wild-type SSI was stable under protease attack, while the mutant inhibitor was hydrolyzed to peptide fragments in an all-or-none manner. The mechanism of this temporary inhibition induced by the amino acid substitution was studied on the basis of structural, thermodynamic, and kinetic data obtained by a combined use of NMR, hydrogen-deuterium exchange, differential scanning calorimetry, and gel filtration HPLC. The mutation did not induce major structural changes, and in particular, the structure of the enzyme-binding region was virtually unaffected. The denaturation temperature of SSI, however, was decreased by 10 deg upon mutation, although it still remained a thermostable protein with a denaturation temperature of 73-degrees-C. Furthermore, the activation enthalpy for denaturation was reduced dramatically, to half that of the wild type. When the mutated SSI is present in excess of the enzyme, the proteolysis followed first-order reaction kinetics with respect to the total concentration of the mutated SSI molecules present. From these combined results, we conclude that the proteolysis proceeds not through the native form of the inhibitor in the inhibitor-enzyme complex but through the denatured (unfolded) form of the inhibitor whose fraction is increased by the mutation. This conclusion states that the necessary condition for being a serine protease inhibitor lies not only in the design of the reactive site structure that is highly resistant to protease attack but also in the suppression of such structural fluctuation that brings about cooperative denaturation. In contrast, when the protease existed in excess of the mutated inhibitor, the proteolysis reaction was accelerated by more than 2 orders of magnitude. Furthermore, the reaction occurred even in the wild-type SSI at a comparable rate as in the mutated protein. This indicates that in the enzyme excess case another, more efficient digestion mechanism involving fluctuation within the native manifold of the inhibitor dominates.AMER CHEMICAL SOC, 1991年05月, BIOCHEMISTRY, 30(21) (21), 5275 - 5286, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- WILEY-LISS, 1988年, PROTEINS-STRUCTURE FUNCTION AND GENETICS, 4(2) (2), 131 - 136, 英語INTERNAL MOTION OF A TRYPTOPHAN RESIDUE IN STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITOR - DEUTERIUM NUCLEAR MAGNETIC-RESONANCE IN SOLUTION[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- NATL ACAD PRESS, 1987年11月, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 84(22) (22), 7841 - 7845, 英語PROTON NUCLEAR-MAGNETIC-RESONANCE STUDY ON THE SOLUTION CONFORMATION OF HUMAN EPIDERMAL GROWTH-FACTOR[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2020年, KURNS-EKR (Web), (6) (6)アミロイド核形成メカニズムの解明を目指した核形成中間体の捕捉と構造解析
- 2019年, KURNS-EKR (Web), (3) (3)フィブリノーゲンによるインスリンB鎖アミロイド線維の形成阻害
- 応用物理学会, 2016年, 応用物理, 85(8) (8), 689 - 692, 日本語タンパク質の動的挙動に及ぼす水和および熱活性の影響；広帯域誘電分光法による観測[査読有り]記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）
- 日本生物工学会, 2008年, 日本生物工学会大会講演要旨集, 20, 167 - 167, 日本語3Fa04 部位特異的化学修飾された抗菌ペプチドThanatinのNMR構造解析と抗菌活性との関係(ペプチド工学・プロテオーム,一般講演)
- Functional tolerance of Streptomyces subtilisin inhibitor toward conformational and stability changes caused by single-point mutations in the hydrophobic coreSingle amino acid mutations of Met103 in the hydrophobic core of a serine protease inhibitor, Streptomyces subtilisin inhibitor, caused little change in the inhibitory activity, as measured by the inhibitor constant, although some altered the thermodynamic stability of the protein considerably. H-1 NMR investigations showed that the conformational stress caused by the replacement of Met103 with Gly, Ala, Val, and Ile, namely, the effects of the cavities generated by replacements with smaller side-chains and of the steric distortions generated by beta-branched side-chains, caused considerable changes in the structural arrangement of the side-chains within the core. However, these structural changes were absorbed within the hydrophobic core, without distorting the structure of the reactive site essential for the protein function. These results provide an excellent example of the conformational flexibility of a protein core and the degree of its tolerance of an amino acid replacement. The results also reveal the crucially designed structural relationship between the core of the inhibitor and the enzyme-binding segment with the reactive site in a serine protease inhibitor.JAPANESE BIOCHEMICAL SOC, 2002年12月, JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 132(6) (6), 991 - 995, 英語
- 2001年09月24日, 分子構造総合討論会講演要旨集, 2001, 250, 日本語生体高分子の遠赤外吸収スペクトルにおけるパワー則
- 2000年09月27日, 分子構造総合討論会講演要旨集, 2000, 279, 日本語テラヘルツ電磁波を利用した遠赤外吸収測定 生体高分子への応用
- 一般社団法人 日本生物物理学会, 2000年, 生物物理, 40(0) (0), S9, 日本語
- 一般社団法人日本生物物理学会, 1997年10月, 生物物理, 37, S106, 日本語SSIの低温変性構造のキャラクタリゼーション
- 一般社団法人日本生物物理学会, 1997年10月, 生物物理, 37, S105, 日本語SSIの低温変性構造の形成過程
- OXFORD UNIV PRESS UNITED KINGDOM, 1994年09月, PROTEIN ENGINEERING, 7(9) (9), 1156 - 1157, 英語FUNCTIONAL STRUCTURE OF PROTEASE INHIBITOR - STRUCTURAL REQUIREMENTS IN SSI FOR ITS INHIBITORY-ACTION研究発表ペーパー・要旨（国際会議）
- INTERACTION OF SUBTILISIN BPN' AND RECOMBINANT STREPTOMYCES SUBTILISIN INHIBITORS WITH SUBSTITUTED-P(1) SITE RESIDUESkinetic analysis was performed on the interaction between subtilisin BPN' and recombinant species of a proteinaceous proteinase inhibitor, Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI), of which the P, site amino acid residue, Met73, was replaced by site-directed mutagenesis. The inhibitor constant, K(i), was determined from the residual enzyme activity by using a peptide substrate. The rate constant of binding, k(on), and the rate constant of dissociation, k(off), were determined from a progress curve of the substrate hydrolysis in the presence of the inhibitor by using newly derived equations. A recombinant SSI in which Met73 was replaced by Ile showed an affinity (1/K(i)) toward subtilisin BPN' of only about 7% of that of the wild-type SSI, and the kinetic analysis revealed that the increase of k(off) was responsible for this difference. The affinity of other SSI mutants in which Met73 was replaced by Glu or Asp decreased significantly as pH became increasingly alkaline. The decrease in the affinity of these recombinants was due to the decrease of k(on) rather than the increase of k(off). Stopped-flow studies revealed that the binding reaction was reconcilable with a two-step mechanism, and the kinetic parameters for each step were obtained for the binding of the enzyme and recombinant SSIs.JAPANESE BIOCHEMICAL SOC, 1993年10月, JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 114(4) (4), 553 - 559, 英語
- 分担執筆, 人工設計ペプチドを用いたレアメタルの選択回収, シーエムシー・リサーチ, 2024年03月, ISBN: 9784910581507微生物機能を活用したレアメタル・貴金属リサイクル
- 分担執筆, タンパク質の低温変性, 丸善出版, 2020年08月熱量測定・熱分析ハンドブック 第3版
- その他, 技術情報協会, 2017年12月, 日本語ペプチド医薬品のスクリーニング・安定化・製剤化技術学術書
- その他, シーエムシー出版, 2015年07月, 日本語, 選択的レアメタル/アース回収能を持った人工設計ペプチドの創製バイオベース資源確保戦略 –都市鉱山・海底鉱山に眠る貴金属・レアメタル等の 分離・回収技術-学術書
- その他, Proceedings of 3rd International THz-Bio Workshop, 2012年, 英語Temperature and hydration dependence of low-frequency dynamics of two muscle proteins studied by terahertz time-domain spectroscopy学術書
- その他, Proceedings of the conference IRMMW-THz 2011, 2011年, 英語Low-frequency dynamics of functional proteins studied by terahertz time-domain spectroscopy学術書
- Elsevier, Amsterdam, 1999年「タンパク質フォールディングの新旧視点」低温変性とタンパク質の低温でのフォールディング
- 共著, Elsevier; Amsterdam, 1999年, 英語Cold denaturation and folding/unfolding of a protein at low temperature in “Old and New Views of Protein Folding”学術書
- バイオインタラクション研究会第11回ワークショップ(オンライン), 2020年11月, 日本語, 京都, 日本国, 国内会議人工設計ペプチドナノファイバーの構造・熱力学的解析[招待有り]シンポジウム・ワークショップパネル（指名）
- 第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 英語, Web上での発表, 国内会議Secondary structure transformation of artificially designed peptide nanofibers口頭発表（一般）
- 第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 日本語, Web上での発表, 国内会議Design of cyclic and linear peptides interacting with transition metal ionsポスター発表
- 若手フロンティア研究会2019, 2019年12月, 日本語腫瘍細胞破壊能を有するpH応答性人工設計ペプチドポスター発表
- 若手フロンティア研究会2019, 2019年12月, 日本語亜鉛結合能を持つペプチドの人工設計ポスター発表
- 若手フロンティア研究会2019, 2019年12月, 日本語遷移金属イオンと相互作用する環状及び鎖状ペプチドの設計ポスター発表
- 若手フロンティア研究会2019, 2019年12月, 日本語構造転移能を有するペプチドナノファイバーの人工設計ポスター発表
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- 第19回日本蛋白質科学会年会･第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会, 2019年06月, 日本語, 神戸国際会議場, 国内会議種々の脂質に対するpH 応答性ヘリックス型人工設計ペプチドの膜破壊能の評価ポスター発表
- 第19回日本蛋白質科学会年会･第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会, 2019年06月, 英語, 神戸国際会議場, 国内会議Trapping and structural analysis of nucleation intermediates aimed at clarifying amyloid nucleation mechanismsポスター発表
- 第19回日本蛋白質科学会年会･第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会, 2019年06月, 英語, 神戸国際会議場, 国内会議Molecular design of peptide enzymes intended to form fibersポスター発表
- 第19回日本蛋白質科学会年会･第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会, 2019年06月, 英語, 神戸国際会議場, 国内会議Designing an α-helical peptide nanofiber with α-β conformational switching abilityポスター発表
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- 第66回 日本生化学会 近畿支部例会, 2019年05月, 日本語, 京都大学宇治キャンパス, 国内会議人工設計ペプチドによるナノファイバーの形成とその構造制御（口頭）口頭発表（一般）
- 第66回 日本生化学会 近畿支部例会, 2019年05月, 日本語, 京都大学宇治キャンパス, 国内会議人工設計ペプチドによるナノファイバーの形成とその構造制御（ポスター）ポスター発表
- 第66回 日本生化学会 近畿支部例会, 2019年05月, 日本語, 京都大学宇治キャンパス, 国内会議EF-handモチーフを導入したカルシウム結合型ペプチドの設計とそのナノファイバー化（口頭）口頭発表（一般）
- 第66回 日本生化学会 近畿支部例会, 2019年05月, 日本語, 京都大学宇治キャンパス, 国内会議EF-handモチーフを導入したカルシウム結合型ペプチドの設計とそのナノファイバー化（ポスター）ポスター発表
- 京都大学複合原子力科学研究所 第53回学術講演会プログラム, 2019年02月, 日本語, 京都大学複合原子力科学研究所, 国内会議フィブリノーゲンによるインスリンB鎖アミロイド線維の形成阻害ポスター発表
- 非共有結合系の分子科学：計測技術から探る生体分子科学の新展開/研究プロジェクト「非共有結合系分子科学研究」, 2019年01月, 日本語, 神戸大学 理学部Z201・Z202号室, 国内会議ナノファイバー形成能を有するペプチド酵素の分子設計ポスター発表
- 非共有結合系の分子科学：計測技術から探る生体分子科学の新展開/研究プロジェクト「非共有結合系分子科学研究」, 2019年01月, 英語, 神戸大学 理学部Z201・Z202号室, 国内会議Structural Characterization of Amyloid Nucleation Intermediates of Insulin B Chainポスター発表
- 非共有結合系の分子科学：計測技術から探る生体分子科学の新展開/研究プロジェクト「非共有結合系分子科学研究」, 2019年01月, 日本語, 神戸大学 理学部Z201・Z202号室, 国内会議pH変化に応じて膜破壊能を持つヘリックス型ペプチドの分子設計ポスター発表
- 神戸大学 研究基盤センター 若手フロンティア研究会, 2018年12月, 日本語, 神戸大学百年記念館, 国内会議ナノファイバー形成による人工酵素ペプチドの高機能化ポスター発表
- 神戸大学 研究基盤センター 若手フロンティア研究会, 2018年12月, 日本語, 神戸大学百年記念館, 国内会議カルシウムイオン結合能及びナノファイバー形成能を有するペプチド設計ポスター発表
- 神戸大学 研究基盤センター 若手フロンティア研究会, 2018年12月, 日本語, 神戸大学百年記念館, 国内会議アミロイド核形成メカニズムの解明を目指した核形成中間体の捕捉および構造解析ポスター発表
- 神戸大学 研究基盤センター 若手フロンティア研究会, 2018年12月, 日本語, 神戸大学百年記念館, 国内会議pH応答性膜破壊能を有するヘリックス型設計ペプチドポスター発表
- 第56回日本生物物理学会年会, 2018年09月, 英語, 岡山大学 津島キャンパス, 国内会議Structural comparison of amyloid nucleation intermediates of insulin B chain formed at different pHsポスター発表
- 第91回日本生化学会大会, 2018年09月, 日本語, 国立京都国際会館, 国内会議pH変化に応じて膜破壊能を持つヘリックス型人工設計ペプチド (口頭)口頭発表（一般）
- 第91回日本生化学会大会, 2018年09月, 日本語, 国立京都国際会館, 国内会議pH変化に応じて膜破壊能を持つヘリックス型人工設計ペプチド (ポスター)ポスター発表
- 第56回日本生物物理学会年会, 2018年09月, 英語, 岡山大学 津島キャンパス, 国内会議Investigation of multi-step nucleation of insulin B chain amyloid fibrils and its inhibition口頭発表（一般）
- 第18回日本蛋白質科学会 ワークショップ「分子夾雑の蛋白質科学」, 2018年06月, 日本語, 朱鷺メッセ, 国内会議様々なpHにおけるインスリンB鎖のアミロイド核形成反応中間体の観察ポスター発表
- 第18回日本蛋白質科学会, 2018年06月, 日本語, 朱鷺メッセ, 国内会議様々なpHにおけるインスリンB鎖のアミロイド核形成反応中間体の観察ポスター発表
- 第18回日本蛋白質科学会 ワークショップ「分子夾雑の蛋白質科学」, 2018年06月, 日本語, 朱鷺メッセ, 国内会議タンパク質の広帯域誘電分光；水和水ダイナミクスおよびその熱活性の検証ポスター発表
- 第18回日本蛋白質科学会, 2018年06月, 日本語, 朱鷺メッセ, 国内会議タンパク質の広帯域誘電分光；水和水ダイナミクスおよびその熱活性の検証ポスター発表
- 第65回日本生化学会 近畿支部例会, 2018年05月, 日本語, 兵庫医科大学 教育研究棟, 国内会議活性部位をbヘアピンに組み込んだミニチュア酵素の分子設計口頭発表（一般）
- 第65回日本生化学会 近畿支部例会, 2018年05月, 日本語, 兵庫医科大学 教育研究棟, 国内会議カルシウムイオン結合能及びナノファイバー形成能を有するペプチドの分子設計口頭発表（一般）
- 第65回日本生化学会 近畿支部例会, 2018年05月, 日本語, 兵庫医科大学 教育研究棟, 国内会議pH応答性構造転移能および膜破壊能を有するペプチドの分子設計口頭発表（一般）
- 新学術領域「動的秩序と機能」第6回国際シンポジウム, 2018年01月, 英語, TKP浜松アクトタワーカンファレンスセンター, 国内会議Characterization and stabilization of prefibrillar aggregate of insulin B chain for inhibition of amyloid fibril formationポスター発表
- 神戸大学 研究基盤センター 若手フロンティア研究会2017, 2017年12月, 日本語, 神戸大学, 国内会議炭酸カルシウム結晶制御を目指したカルシウムイオンと結合する自己集合型ペプチドの分子設計ポスター発表
- 2017年度生命科学系学会合同年次大会, 2017年12月, 日本語, 神戸ポートアイランド, 国内会議耐熱性α-ヘリックス型ペプチドナノファイバーの人工設計ポスター発表
- 2017年度生命科学系学会合同年次大会, 2017年12月, 日本語, 神戸ポートアイランド, 国内会議カルシウムイオンとの結合能を持った自己集合型ペプチドの分子設計(口頭)口頭発表（一般）
- 2017年度生命科学系学会合同年次大会, 2017年12月, 日本語, 神戸ポートアイランド, 国内会議カルシウムイオンとの結合能を持った自己集合型ペプチドの分子設計(ポスター)ポスター発表
- 第55回日本生物物理学会年会, 2017年09月, 日本語, 熊本大学 黒髪北地区, 国内会議アミロイド分解能を有する人工ペプチドの設計口頭発表（一般）
- 第55回日本生物物理学会年会, 2017年09月, 日本語, 熊本大学 黒髪北地区, 国内会議アミロイド核前駆体として機能する前駆中間凝集体のキャラクタリゼーション口頭発表（一般）
- 第17回日本蛋白質科学会年会, 2017年06月, 日本語, 仙台国際センター, 国内会議超音波照射によるインスリンB 鎖アミロイド前駆中間体の線維化誘導ポスター発表
- 第17回日本蛋白質科学会年会, 2017年06月, 英語, 仙台国際センター, 国内会議アミロイド線維を分解する人工設計ペプチドポスター発表
- 第64回日本生化学会近畿支部例会, 2017年05月, 日本語, 大阪大学豊中キャンパス, 国内会議耐熱性ナノファイバーを形成する両親媒性ヘリックスペプチドの分子設計口頭発表（一般）
- 第64回日本生化学会近畿支部例会, 2017年05月, 日本語, 大阪大学豊中キャンパス, 国内会議カルシウムイオンと結合する自己集合型ペプチドの設計口頭発表（一般）
- 新学術領域「動的秩序と機能」第5回国際シンポジウム, 2017年01月, 英語, 東京大学駒場キャンパス, 国際会議Role of prefibrillar intermediates of insulin B chain in its amyloid fibril formationポスター発表
- Japan-Taiwan Medical Spectroscopy International Symposium, 2016年12月, 英語, 淡路夢舞台国際会議場, 国際会議Protein Hydration Dynamics Studied by Broadband Dielectric Spectroscopy口頭発表（一般）
- 第54回日本生物物理学会年会, 2016年11月, 英語, つくば国際会議場, 国内会議Design of peptides that specifically bind to the rare metalポスター発表
- 第89回日本生化学会大会, 2016年09月, 日本語, 日本生化学会, 仙台国際センター/東北大学川内北キャンパス, 国内会議ドラッグデリバリーを志向したペプチドナノチューブの分子設計ポスター発表
- The Protein Society 2016 Annual Symposium, 2016年07月, 英語, The Protein Society, Baltimore, MD, USA, 国際会議Artificially designed peptides that degrade amyloid fibrils.ポスター発表
- 第16回日本蛋白質科学会年会, 2016年06月, 日本語, 福岡国際会議場, 国内会議線維前駆中間体を経由したアミロイド線維形成機構 －インスリン B 鎖が形成する初期会合体のキャラクタリゼーション－ポスター発表
- 第88回日本生化学会大会, 2015年12月, 日本語, 神戸国際会議場, 国内会議薬剤候補化合物を内包する自己集合ペプチドなのチューブの分子設計ポスター発表
- 第53回日本生物物理学会, 2015年09月, 英語, 金沢, 国内会議Hydrolysis of lipid droplets by artificially designed peptides口頭発表（一般）
- 第3回日本アミロイドー シス研究会学術集会, 2015年08月, 日本語, 東京都(KKRホテル東京), 国内会議アミロイド線維分解能を持つミニチュア酵素の人工設計口頭発表（一般）
- AWEST2015, 2015年06月, 英語, 淡路夢舞台国際会議場, 国際会議Temperature and Hydration Dependence ofthe Complex Dielectric spectra of proteins at GHz and THz regions obtained by THz Time-domain spectroscopy and dielectric spectroscopy口頭発表（招待・特別）
- ライフサイエンス ワールド 2015（第12回アカデミックフォーラム）, 2015年05月, 日本語, リード エグジビション ジャパン 株式会社, 東京ビッグサイト, 国内会議機能性ペプチドの人工設計：アミロイド分解能を持つミニチュア酵素の創製へ口頭発表（一般）
- 第33回シーズ公開会, 2015年02月, 日本語, 大阪科学技術センター, 国内会議新機能を有するペプチド分子の人工設計:アミロイド分解能とレアメタル結合回収能[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 平成26年度「大学発！ 環境技術シーズ発表会」, 2014年12月, 日本語, 近畿経済産業局, 大阪市北区 阪急ターミナルビル17F, 国内会議人工設計ペプチドを用いたレアメタルのリサイクル＆センシング[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 第87回日本生化学会大会, 2014年10月, 日本語, 国内会議球状中空構造を有するペプチド集合体の分子設計ポスター発表
- ライフサイエンス分野における先進研究～機能性材料とその加工技術を中心に～, 2014年10月, 日本語, 公社） 新化学技術推進協会, 新化学技術推進協会会議室(東京都), 国内会議ペプチドデザイン技術を用いた新規機能性物質設計：レアメタルリサイクルとアミロイド分解[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 8th International Conference on Broadband Dielectric Spectroscopy and its Applications, 2014年09月, 英語, Wisla (POLAND), 国際会議Temperature and Hydration Dependence of Complex Dielectric Spectra of Lysozyme from GHz to THz Frequency Region口頭発表（一般）
- 第52回日本生物物理学会年会, 2014年09月, 日本語, 札幌コンベンションセンター, 国内会議Hydrolysis of amyloid fibrils by artificially designed peptidesポスター発表
- 第52回日本生物物理学会年会, 2014年09月, 英語, 札幌コンベンションセンター, 国内会議Design of a peptide nanotube having the capability of rare metal binding./Hydrolysis of amyloid fibrils by artificially designed peptidesポスター発表
- 若手フロンティア研究会2013, 2013年12月, 日本語, 神戸大学 研究基盤センター, 神戸, 国内会議ナノ会合体の形成に及ぼすhelix間相互作用部位の影響口頭発表（一般）
- 第51回日本生物物理学会年会, 2013年10月, 英語, 京都, 国内会議Temperature and hydration dependence of low-frequency dynamics of lysozyme studied by terahertz time-domail spectroscopy口頭発表（一般）
- 第51回日本生物物理学会年会, 2013年10月, 英語, 京都, 国内会議Low-frequency dynamics of Trehalose-coated Lysozyme studied by terahertz time-domain spectroscopy口頭発表（一般）
- 第51回日本生物物理学会年会, 2013年10月, 英語, 京都, 国内会議Hydrolysis of lipid droplets and amyloid fibrils by the designed peptideポスター発表
- 第51回日本生物物理学会年会, 2013年10月, 英語, 京都, 国内会議Design of transmembrane peptide for constructing a signaling modelポスター発表
- 第51回日本生物物理学会年会, 2013年10月, 英語, 京都, 国内会議Design of Photo-controllable Cyclic Peptidesポスター発表
- 新化学技術推進協会講演会, 2013年04月, 日本語, 東京, 国内会議ペプチドナノチューブの人工デザイン –新機能バイオ材料の創製を目指して-[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 先端融合科学シンポジウム「タンパク質アセンブリ －会合、超分子化、凝集－」, 2012年01月, 日本語, 神戸, 国内会議芳香族化合物と相互作用するペプチドナノチューブの分子設計ポスター発表
- 先端融合科学シンポジウム「タンパク質アセンブリ －会合、超分子化、凝集－」, 2012年01月, 日本語, 神戸, 国内会議複孔性ペプチドナノチューブの分子設計ポスター発表
- 先端融合科学シンポジウム, 2012年01月, 日本語, 神戸, 国内会議機能性ペプチドナノチューブの人工設計[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 先端融合科学シンポジウム「タンパク質アセンブリ －会合、超分子化、凝集－」, 2012年01月, 日本語, 神戸, 国内会議ヘリックス間相互作用によって誘起されるペプチドナノ構造体の設計ポスター発表
- DAE-BRNS 11th Biennial Trombay Symposium on Radiation & Photochemistry (TSRP 2012), 2012年01月, 英語, Mumbai, India, 国際会議Terahertz time-domain spectroscopy on proteins and polypeptides –Effect of thermal activation and hydration on low-frequency dynamics[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 第８４回日本生化学会大会, 2011年09月, 日本語, 京都, 国内会議膜結合能を有するペプチドナノチューブの分子設計ポスター発表
- 分子科学討論会2011, 2011年09月, 日本語, 札幌, 国内会議グラファイト-液体界面に集積したペプチドナノチューブの構造ポスター発表
- 第２回メディショナルナノテク研究会, 2011年07月, 日本語, 大阪, 国内会議人工設計ペプチドが織り成す構造体の世界-分子からナノチューブまで-[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 第１１回 日本蛋白質科学会年会, 2011年06月, 日本語, 大阪, 国内会議シグナル伝達モデル系の構築を目指した水溶性膜貫通ペプチドの設計ポスター発表
- International Workshop on Optical Terahertz Science and Technology, 2011年03月, 英語, Santa Barbara, USA, 国際会議Hydration effect of biological reactions studied by terahertz time-domain spectroscopyポスター発表
- 18th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy, 2010年12月, 英語, Izu, Japan, 国際会議Peptide Nanotubes Observed by Frequency-Modulation Atomic Force Microscopy口頭発表（一般）
- 分子高次系機能解明のための分子科学シンポジウム, 2010年11月, 日本語, 仙台, 国内会議周波数変調型原子間力顕微鏡によるペプチドナノチューブの観察ポスター発表
- The 4th International Symposium on “Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions”, 2010年11月, 英語, Ohtsu, Japan, 国際会議Low-frequency Dynamics of Myoglobin by Terahertz Time-Domain Spectoscopyポスター発表
- The 4th International Symposium on “Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions”, 2010年11月, 英語, Ohtsu, Japan, 国際会議Effect of secondary structural formation on low-frequency dynamics of poly-L-glutamic acid studied by terahertz time-domain spectroscopyポスター発表
- The 4th International Symposium on “Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions”, 2010年11月, 英語, Ohtsu, Japan, 国際会議DESIGN OF NOVEL METAL-BINDING PROTEINS BASED ON INFLUENZA M2 PROTEINポスター発表
- International Conference on Infrared Millimeter Wave and THz, 2010年09月, 英語, Rome, Italy, 国際会議Terahertz time-domain spectroscopy on proteins, peptides, and small biological moleculesポスター発表
- Asia Pacific Symposium on Radiation Chemistry, 2010年09月, 英語, Lonavala, India, 国際会議Terahertz Time-Domain Spectroscopy on Biological Samplesポスター発表
- 第32回日本分子生物学会年会, 2009年12月, 日本語, 横浜, 国内会議GTP結合型Rasの構造遷移における分子メカニズムの解析ポスター発表
- 第８２回日本生化学会大会, 2009年10月, 日本語, 神戸, 国内会議分子間相互作用によりナノ構造体を形成するペプチドの設計[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 第47回日本生物物理学会年会, 2009年10月, 英語, 徳島, 国内会議De novo design of membrane-active proteinsポスター発表
- Joint International Open Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions and Chemistry of Biological Processes Created by Water and Biomolecules, 2009年03月, 英語, Okazaki, Japan, 国際会議Designing proteins with dynamic channeling capability by utilizing membrane fluidityポスター発表
- 第４６回生物物理学会, 2008年12月, 英語, 福岡, 国際会議Searching for key factors in designing antimicrobial peptidesポスター発表
- 第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会 合同大会, 2008年12月, 英語, 神戸, 国際会議Role of the regional polymorphism in GTP-bound H-Ras on effector recognitionポスター発表
- 第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会 合同大会, 2008年12月, 英語, 神戸, 国際会議Design of peptide-nanocage based on the coiled-coil formationポスター発表
- 5th Open Workshop for "Chemistry of Biological Processes Created by Water and Biomolecules", 2008年01月, 英語, Nara, Japan, 国際会議Structure-activity relatioships of designed antimicrobial peptidesポスター発表
- 5th Open Workshop for "Chemistry of Biological Processes Created by Water and Biomolecules", 2008年01月, 英語, Nara, Japan, 国際会議Decrease in solubility induces formation of a soft-packed protein structure: Implication of the primordial step in protein foldingポスター発表
- 第４５回生物物理学会年会, 2007年12月, 日本語, 横浜, 国内会議立体構造変化に伴い機能発現する抗菌ペプチドの設計口頭発表（一般）
- 日本生物物理学会第45回年会, 2007年12月, 日本語, 横浜, 国内会議凍結乾燥状態における poly-l-lysine の低振動スペクトルとその二次構造口頭発表（一般）
- 日本生物物理学会第45回年会, 2007年12月, 日本語, 横浜, 国内会議金属イオン結合性ペプチドナノチューブのデザインポスター発表
- 2007 International Symposium on “G-protein Signaling”, 2007年07月, 英語, Tokyo Japan, 国際会議New strategy to develop Ras-specific inhibitors based on conformational equilibrium of Ras oncoprotein口頭発表（一般）
- 第７回日本蛋白質科学会年会, 2007年05月, 日本語, 仙台, 国内会議立体構造変化に伴い機能発現する抗菌ペプチドの設計ポスター発表
- 第６回CREST 若手討論会, 2006年01月, 日本語, 神戸, 国内会議タンパク質の人工デザイン：分子からナノファイバーへ口頭発表（招待・特別）
- 第53回質量分析総合討論会, 2005年05月, 日本語, さいたま, 国内会議ナノエレクトロスプレーイオン化四重極/飛行時間型タンデム質量分析法を用いた分子量6,000 を超える分子量ペプチドのアミノ酸配列析：in-house 配列データベース検索エンジンの新たな利用法口頭発表（一般）
- US-Japan Symposium on Folding, Design and Dynamics, 2005年05月, 英語, Philadelphia, USA, 国際会議Designing β-sheets from unstructured or α-helical peptides口頭発表（招待・特別）
- Workshop on " Water and Biomolecules.", 2005年03月, 英語, 未記入, Tokyo, Japan, 国内会議Formation of the peptide nanofiber and its application as functional materials口頭発表（一般）
- XX Congress of the International Union of Crytallography, 2005年, 英語, Florence, Italy, 国際会議Crystal structure of the small G protein M-Ras and its implications口頭発表（一般）
- US-Japan Symposium on Folding, Design and Dynamics, 2005年01月, 英語, 岡崎, 国内会議Designing β-sheet proteins from unstructured or α-helical peptide fragmentsポスター発表
- 第42回日本生物物理学会, 2004年12月, 日本語, 未記入, 京都, 国内会議単層bシートに基づく安定なbシートペプチドのデザイン口頭発表（一般）
- 第42回日本生物物理学会, 2004年12月, 日本語, 日本生物物理学会, 京都, 国内会議進化分子工学によるsubtilisinの低温高機能化口頭発表（一般）
- 第42回日本生物物理学会, 2004年12月, 日本語, 日本生物物理学会, 京都, 国内会議ペプチドのナノファイバーへの自己集合とそのバイオマテリアルとしての利用口頭発表（一般）
- 第42回日本生物物理学会年会, 2004年12月, 日本語, 日本生物物理学会, 京都, 国内会議シトクロムb5 のDEPC 処理によって明らかにされたアスコルビン酸依存性シトクロムb561 の還元機構口頭発表（一般）
- 第43回NMR討論会, 2004年11月, 日本語, 未記入, 東京, 国内会議新規デザインを利用した小型タンパク質立体構造安定化機構口頭発表（一般）
- 大阪大学蛋白質研究所セミナー「蛋白質の自己組織化メカニズム-折り畳み、デザイン、アミロイド形成-」, 2004年11月, 日本語, 未記入, 大阪, 国内会議ペプチドナノファイバー：構造デザインと機能付与口頭発表（招待・特別）
- CREST若手討論研究会, 2004年07月, 日本語, 未記入, 湯河原、神奈川, 国内会議シトクロムb5 のDEPC 処理によって明らかにされたアスコルビン酸依存性シトクロムb561 の還元機構口頭発表（一般）
- 特定領域「水と生体分子」合同班会議, 2004年06月, 日本語, 未記入, 滋賀, 国内会議タンパク質のフォールディング理論、立体構造予測、及び分子設計口頭発表（招待・特別）
- The 1st Pacific-Rim International Conferenceon Protein Science, 2004年04月, 英語, 未記入, Yokohama, Japan, 国内会議Fibrious assembly of the amphipathic α-helix forming polypeptideポスター発表
- The 1st Pacific-Rim International Conferenceon Protein Science, 2004年04月, 英語, 未記入, Yokohama, Japan, 国内会議Drsigning stable b-sheet peptides based on the single layer b-sheetポスター発表
- The 1st Pacific-Rim International Conference on Protein Science, 2004年04月, 英語, 未記入, Yokohama, Japan, 国内会議Creation of a new biomaterial by the self-assembled peptide nanofiberポスター発表
- The 9th Keihanna Conference on Molecular Biophysics,"Physical Aspects of Protein Folding and Function", 2004年01月, 英語, 未記入, kyoto, Japan, 国内会議Structural and Thermodynamic Characterization of Designed Proteins口頭発表（招待・特別）
■ 共同研究・競争的資金等の研究課題
- 学術研究助成基金助成金／挑戦的萌芽研究, 2015年04月 - 2018年03月, 研究代表者競争的資金
- 科学研究費補助金／基盤研究(B), 2014年04月 - 2017年03月, 研究代表者競争的資金
- 研究成果展開事業（マッチングプランナー プログラム）, 2016年, 研究代表者レアメタルの回収/センシング能を有するペプチドナノチューブの人工設計競争的資金
- 科学技術振興機構, 研究成果展開事業 マッチングプランナープログラム 探索試験, 2015年, 研究代表者マッチングプランナー「レアメタルの回収/センシング能を有するペプチドナノチューブの人工設計」競争的資金
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(C), 神戸大学, 2011年 - 2013年Ｒａｓ－Ｒａｆ結合阻害活性を有する抗がん剤の創製rasがん遺伝子産物Rasは低分子量G蛋白質であり、多くの癌において活性化が認められることから、その機能を阻害する抗癌剤の開発が切望されている。我々は、GTP結合型Rasに特異的なポケット構造に基づいた大規模なスクリーニングを通じて、担がん動物において抗がん活性を示す複数の化合物群（Kobe0065ならびにその誘導体）の同定に成功した。これらの化合物は、Rasと標的蛋白質ならびに上流の調節因子との結合を阻害することでRasのシグナル伝達を阻害し、顕著な抗がん作用を示すことが明らかになった。さらに、これらの化合物は、市販の抗癌剤には認められない癌細胞の転移抑制作用を示すことも明らかになった。
- 研究成果最適展開支援プログラム フィージビリティスタディステージ 探索タイプ, 2013年, 研究代表者A-STEP「PdまたはPtイオンの選択的抽出に向けた環状ペプチドナノチューブの最適化」競争的資金
- 研究成果最適展開支援プログラム フィージビリティスタディステージ 探索タイプ, 2012年, 研究代表者A-STEP「PdまたはPtイオンの選択的抽出に向けた環状ペプチドナノチューブの最適化」競争的資金
- 学術研究助成基金助成金／基盤研究(C), 2011年, 研究代表者競争的資金
- 科学研究費補助金／基盤研究(B), 2007年, 研究代表者競争的資金
- 科学研究費補助金／特定領域研究, 2006年, 研究代表者競争的資金
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 若手研究(B), 神戸大学, 2001年 - 2002年小型タンパク質の構造形成能を左右する必要十分条件の探索タンパク質が構造を形成し、安定に存在するための、必要十分条件を探索することを目的としている。 タンパク質の構造には、アルファヘリックスとベータシートという2種類の二次構造が存在する。アルファヘリックスについては、既にかなり研究されているが、ベータシートに関しては未知な点が多い。そこで、まずベータシートを豊富に含むタンパク質について、その構造安定性について、熱力学的および構造的測定を行うことで、詳細に研究を行った。この結果、1)静電的な相互作用が強くその安定化に寄与していること、2)疎水相互作用が構造単位を維持することに必要なこと、3)構造転移の多段階性、などが明らかになった。特に、1)の結果は、研究に用いたタンパク質に、リジンやグルタミン酸などの電荷を持つたアミノ酸残基が多数存在することで、初めて明らかになったことである。また、2)と3)については、このタンパク質が加熱に従って3段階に変性していくが、これらの構造単位を明らかにし、またその構造がなぜ1単位として安定に存在し得るかを明らかにしたものである。 一方、タンパク質の三次元構造の形成には、これらの二次構造とアミノ酸側鎖を含めた相互作用が必要となる。特に疎水相互作用が重要と考えられるため、タンパク質内部に存在する疎水アミノ酸残基を遺伝子操作によって他のアミノ酸に変換し、その構造形成能の評価を行った。測定には、核磁気共鳴などの分光学的手法と熱測定などの熱力学的手法を併用した。この結果、内部の大きな変換の影響は内部で吸収され、全体立体構造や活性には影響を与えないことが明らかになった。これはタンパク質構造の柔軟性というものを示した点で注目される。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(B), 2000年 - 2001年原子空間に着目する蛋白質研究の新展開ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)は、補酵素NADPHを水素供与体としてジヒドロ葉酸(DHF)をテトラヒドロ葉酸(THF)に還元する反応を触媒する。月向は、この反応に含まれる種々の中間複合体の断熱圧縮率を測定し、反応の進行とともにリガンドの結合・反応・解離により圧縮率が大きく変化すること、また、X線構造から求めたキャビティー量が多いほど圧縮率が大きいことを見出した。このことは、キャビティーがゆらぎの発現の場となっており、機能発現に重要な役割を演じていることを示している。DHFRの3つのフレキシブルループに存在するGly67,Gly121,Ala145位を種々のアミノ酸に置換した結果、圧縮率は1アミノ酸置換により大きく影響を受けることを見出した。圧縮率の大きい変異体ほど酵素活性が高く、構造のゆらぎは機能発現に有利に働いていることがわかった。また、圧縮率の大きい変異体はキャビティーも多く、アミノ酸置換の影響は置換部位から遠く離れた部位でのキャビティーの数や大きさに影響し、ゆらぎの改変をとおして機能にまで及んでいることがわかった。赤坂は高圧NMRを用い、RalGDSのRas結合ドメインは2000気圧までの圧力下で全体の立体構造は壊れないものの、疎水性キャビティーの近傍の構造が解けることを見出した。また、c-Myb R2蛋白質のサブドメインにおいてキャビティーを埋めるようなアミノ酸置換により、耐圧性が増すことを見出した。さらに、Ubiquitinは天然状態で2つのコンフォマーが存在することを見出し、高圧NMRがわずかなエネルギー差による構造変化を敏感に観察できることを示した。このように、蛋白質の原子空間(圧力効果)に着目することにより、蛋白質の構造と機能において新規で重要な知見が得られることがわかった。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 特定領域研究(A), 神戸大学, 2000年 - 2001年人工タンパク質の理論設計と合成本プロジェクトでは、理論モデルに基づいて人工タンパク質を設計し、それを実際に生合成し、その立体構造や折れたたみ反応の熱力学的および速度論的解析を行う。その結果を理論にフィードバックさせることにより理論モデルを改良する。理論家と実験家の共同によりこのサイクルを繰り返し、それを通じてタンパク質の立体構造を形作っている物理化学的な原理を理解するとともに、新規な人工タンパク質を造ることを目指した。【配列設計の結果】モンテカルロアニーリングシミュレーションによって、Zスコアを最小にする配列を探した。設計と折りたたみの繰り返しによる変性状態構造アンサンブルの構築とZスコアの改良によって設計された配列は高いフォールド能力を持ち、Target構造との相同性を高めている。エネルギーランドスケープを見ると、Target構造との相同性(Q値、Q値が大きい程Target構造に近い)が高い程エネルギーが低くなっており、このデザイン配列の高いフォールド能力を示唆している。上の方法を用いてDHB01からDHB20までの配列を設計した。【人工設計タンパク質の合成実験】設計されたアミノ酸配列が実際に立体構造をとっているかどうかを調べるために、この20種のうち、cavity体積などのスコアから評価した上位3種(DHβ06、DHB09、DHB19)を選択しペプチド合成機を用いて化学合成を行い、その構造安定性をCD(円二色性)、NMR(核磁気共鳴)の手法を用いて調べた。far UV領域でのCD測定においてDHB09、DHB19の2種はランダムコイル状のスペクトルであったが、DHB06は典型的なα-ヘリックス様のスペクトルを示した。DHB06の温度に対する安定性を調べたところ90℃において完全変性し、かつこの変性が可逆であることが分かった。そこで、Native-Denatured間の二状態転移モデルで波長222nmにおけるCD値の熱変性曲線のcurve-fittingを行った結果、エンタルピー変化25kcal/mo1および転移中点温度79℃を得た。これは、野性型の値(ΔH=20kcal/mo1、Tm=80℃)に匹敵する値である。一方、1H-NMR測定によるとDHB09やDHB19の一次元NMRスペクトルは、アミノ酸由来のシャープな様相を呈した。対照的にDHB06のスペクトルでは高磁場シフトしたメチル基や低磁場シフトしたヒスチジン残基のピークなど、DHB06が三次構造を持つことが示唆された。この結果は、天然状態様の三次構造を持つ配列設計の成功を示している。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奨励研究(A), 神戸大学, 1999年 - 2000年氷温でのタンパク質構造変化と進化工学による高機能化因子の関連タンパク質として、プロテアーゼの1種サチライシンを用いて、低温での高機能化を進化工学の手法を用いて果たした。具体的には、まず、サチライシンの遺伝子を出発点として、error-prone PCR法という手法で、ランダムに遺伝子DNAに変異を生じさせた。変異確率は、第1回目の集団では、アミノ酸変異として平均2.7個、第2回目の集団では平均1.0個の割合で起こった。第1集団については、サチライシンを単離、精製し、酵素反応速度のパラメーターを分光測定によって求め、活性上昇率が10℃において、3%であることを見い出した。上昇率が高くないのは、変異が多いにもかかわらず、サンプリング数(4万個)が少ないためであると見積ることができたので、第2集団から選び出すことにした。この結果、野生型に比べ明らかに高速に活性が出現するものが約10種、特に2倍以上高速なものが2種得られた。また、高活性体の中で、共通する位置に変異があるものが複数得られ、これら「ホットスポット」を同定することができた。現在これら高活性体の酵素反応速度パラメーターの定量測定を行っている。 一方、サチライシンの一部とアミノ酸配列の相同性のあるタンパク質POIA1について、その立体構造を核磁気共鳴法を用いて決定した。また、構造の基本単位であるαヘリックス構造やβシート構造についての構造生物学的な基礎研究を各種測定法を用いて行った。この結果、長くつらなったβシート構造の意義、分光学的な測定法の開発などに成功した。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 特定領域研究(A), 神戸大学, 1999年 - 1999年人工タンパク質の理論設計と合成本プロジェクトでは、理論モデルに基づいて人工タンパク質を設計し、それを実際に生合成を行う。理論モデルとしてタンパク質骨格の原子NH、C_αH、COをunited atomとしてあらわに表現する一方、側鎖はその重心に一つの球を置いた粗視化モデルを構築した。理論設計は、鋳型構造に対してもっとも適合するアミノ酸配列(σと書く)を探索する。今回は、鋳型構造としてAlbumin binding domainの3本へリックス束構造を選んだ。適合度としてZスコアを使うのが良い。ランダム配列から、配列σを動的変数としてシミュレーテッドアニーリング法を行い、Zスコアが最適になる配列を10個求めた。我々の粗視化モデルに含まれていない側鎖のぶつかり合いを確認するため、AMBER力場による全原子モデルで構造最適化を行って、そのエネルギーが最低のアミノ酸配列を最終的に理論予測配列とした。この配列に相当する遺伝子を合成し、ベクターDNA(pET11)に組み込み大腸菌(BL21(DE3))を形質転換した。現在、大腸菌の大量培養およびタンパク質精製を進めている。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 特定領域研究(A), 神戸大学, 1998年 - 1998年蛋白質の基本構造に対する圧力効果蛋白質の基本構造に対する圧力の効果を知る目的で、申請者の研究室で開発した加圧試料セル型超高磁場高分解能NMR(750MHz)を用いて、1〜2000気圧の範囲で圧力を変化させ、(1)典型的なヘリックス、(2)典型的なランダムコイル構造、及び(3)β-シートをもつ小蛋白質(35残基)について、加圧による構造変化、水との水素結合変化、及びダイナミックスの変化を1H、15Nの化学シフトとスピン緩和に基づいて研究した。 1。ヘリックス及びランダムコイル状態の蜂毒蛋白質メリチンの加圧による水素結合の変化メリチンのへリックス構造(メタノール中)の主鎖アミドプロドン(NH)とプロトンの信号が、圧力に対して直線的にかつ可逆的にしかも部位特異的にシフトすることが明かとなった。これらのシフトは、加圧による二次構造(ヘリックス)の変化、特にアミドとカルボニル基との分子内水素結合(NH…O=C)の短縮を示す。またランダムコイル構造(酸性軽水溶液中)について同様の実験を行い、加圧に伴いポリペプチド鎖と水との水素結合が強化されることを明かにした。 2。バクテリオロドプシンヘリックスの加圧によるダイナミックスの変化15N同位体で均一標識したbacteriorhodopsinのhelix(1-36残基)を対象として、軽水溶液中(90%H20/10%D20)で主鎖アミドの15Nスピン緩和とNOEの測定を行った。 解析の結果、30〜2000barの範囲でヘリックス構造の速いゆらぎには大きな変化がないことが明かとなった。 3。水溶液中の小蛋白質グルマリン(甘味抑制蛋白質;35残基)について、加圧による1H化学シフトの測定を行い、加圧に伴うβ-シートの構造変化、溶媒の水との水素結合の短縮を明らかにした。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奨励研究(A), 神戸大学, 1997年 - 1998年リアルタイム測定によるタンパク質折りたたみ機構の高空間分解能解析1、 タンパク質の同位体標識とその低温での構造 標的タンパク質である、Streptomyces subtilisin inhibitor(SSI)の同位体標識を、15Nを含む硫酸アンモニウムを唯一の窒素源として含む培地で大腸菌を培養することによって得た。これについて、15Nと1H即ち主鎖のペプチド結合に関する相関を、2次元NMRで温度を変化させ測定した。この結果、SSIは0℃という氷温付近に於いて、pH2.7以上では低温変性し構造を失っていること、しかしながら、pHをこれより下げるとnative構造とは異なった特異な構造体となることを、原子レベルの分解能で明らかにした。 2、 重水素ラベル法を用いた構造解析 上記の低温時の特異な構造を決定する際、問題となったのは、シグナルの重複であった。実際、直接決定は不可能であったので、間接的な重水素ラベル法を考案して適用した。これは、低温時に溶媒を重水から軽水(または、軽水から重水)へ変化させ、次にpHと温度をnative条件までジャンプし、測定容易な条件で、タンパク質中の交換不可能な水素、即ち内部に埋もれ構造を取っているアミノ酸残基を特定するものである。この結果、native構造に存在していた強固なβ鎖の内の1本は完全に失われていることなどを見い出した。 3、 リアルタイム測定による折りたたみ機構 折りたたみをpHジャンプまたは温度ジャンプで引き起こし、その後の過程をNMR法または、CD、蛍光法でリアルタイムに測定した。この結果、2段階以上の過程を見い出し、プロリン残基のシス-トランス異性化反応がどの段階に相当するか、また、それより遅い段階で3次構造が形成されることなどを明らかにした。 4、 他のタンパク質への適用 SSI以外のタンパク質(myoglobin,SNase,OspAなど)にも、上記手法の適用を試み、または適用のための基礎的データを得た。これより、タンパク質折りたたみ機構の一般的解明を現在も目指している。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(B), 神戸大学, 1997年 - 1998年加圧による蛋白質立体構造変化の解析1. 当研究室で開発した、1barから2000barまで任意の圧力で高分解能高圧NMR測定可能なオンライン高圧NMR装置(プロトン周波数750MHz)を用い、加圧下での水溶液中の蛋白質のNMR信号の変化を、原則的に全1H、15N(一部13C)原子毎の分解能で解析した。 2. 15N標識したBPTI(basic pancreatic trypsin inhibitor)、Bacteriorhodopsinのhelix(1-36)、HPr(histidine-containing phospho-carrier protein)、RalGEF-RBD(Ral guaninie-nucleotide exchange factor-Ras binding domain)、melittin(蜂毒)などを対象に、軽水中で、主として1H二次元NMR測定と15N/1H二次元NMR測定を行った。 3. 主鎖のほとんどすべてのアミドの1H,15N NMR化学シフトが圧力に対して直線的に、可逆的に、しかも部位特異的に変化した。これらの解析の結果 (1) 加圧に伴い、主鎖アミドの関与するNH…O間水素結合距離の短縮が起こること (2) 加圧に伴い、主鎖コンフォーメーションが部位特異的に変化する。特にヘリックスとループ領域が柔らかいことが明かとなった。 4。 BPTIについて、加圧による1H/1H核オ一バーハウザー効果(NOE)の変化を測定することに成功した。解析の結果、加圧に伴い、三次構造の部位特異的構造変化(主として圧縮)が起こり、同時に芳香族環のフリップ-フロップ運動が抑制されることが判明した。 5. RalGEF-RBDについて、ループ領域から選択的に圧力変性が起こることが15N/1H二次元NMRによって明かとなった。これは圧力変性中間体の存在を明確に示したものであり、今後の蛋白質フォールディング研究へのインパクトが期待される。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 国際学術研究, 神戸大学, 1997年 - 1998年重水素交換と高圧NMRによる蛋白質構造のゆらぎに関する共同研究本共同研究では、蛋白質ウシ脾臓トリブシンインヒビターBPTIを主たる対象に、神戸大学で開発されたオンライン超高分解能高圧NMR装置(750MHz)を用い、1〜2000barの任意の圧力下で、加圧による蛋白質の構造及びダイナミクスの変化について初めて原子レベルの分解能で研究した。通常のBPTI試料はシグマ社製から購入し、15N標識BPTI試料はC.Woodward教授(ミネソタ大学)が作成、また13C標識BPTIはG.Montelione教授(Rutgers大学)から提供していただいた。その成果は以下の通りまとめられる。なお以下の実験の成功に鑑み、多大の時間を要する重水素交換反応に対する圧力効果の測定は中断した。 1. 軽水中のプロトン二次元NMR測定及び15N/1H二次元NMR測定で、主鎖アミドの1H,15Nの信号がともに圧力に対して強い低磁場シフト(それぞれ平均0.075ppm/2kbar,0.47ppm/2kbar)を示すことから、加圧による主鎖アミドの水素結合距離の短縮が明かとなった。 2. 15N信号の圧力シフトはアミノ酸毎に顕著なバリエーション(0〜1.5ppm/2kbar)を示すことから、加圧により二面角φとΨも変化すると考えられる。特にヘリックスとループがβ-シートに比べその変化が大きいことが明かとなった。 3. プロトン核オーバーハウザー(NOE)の測定から、加圧によるBPTIの三次構造変化を測定し、特に酵素との結合セグメントが圧縮され易いことが明かとなった。 4. 15Nスピン緩和の測定から、加圧による主鎖のnsec〜psec程度の速い内部運動の変化について研究したところ、部位により若干の変化が認められ、詳細を解析中である。 5. ミリ秒程度の時間域での遅い運動については、プロトンNMRスペクトルから、加圧により一部のTyr,Pheの環回転が遅くなることが判明し、その原因が残基間距離の短縮によることが明かとなった 6. 13C信号の化学シフトの加圧に伴うシフトの測定に成功し、結果を解析中である。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奨励研究(A), 神戸大学, 1996年 - 1996年タンパク質構造転移の多層性Streoptomyces subtilisin inhibitor(SSI)というタンパク質の存在状態が、温度、pHによってどう変わるかを示す相図を作成した。これは、円二色性(CD)装置を用い、タンパク質の二次構造を反映する遠紫外領域、および三次構造を反映する近紫外領域の測定を、温度、pHを変化させて行うことで得たものである。この結果、SSIの構造転移について以下のことが明らかになった。 1,native構造は、室温から温度を上げた場合だけでなく、下げた場合にも壊れる。後者即ち低温変性は、以前報告されたような特殊なものではなく、タンパク質に一般的なメカニズムおよび熱力学的量を示した。 2,ところが、1で述べた一般的な低温変性が起こった後に、native構造とは全く異なった三次構造および熱力学量をもった状態(D′)を新たに形成する。 3,pH2.4以下では、D′状態から温度を上げると、三次構造はほとんど高温変性構造と同等に壊れているが、二次構造は半分程度しか壊れていない中間状態となる1段目の転移と、引き続き高度に変性する2段目の転移が起こる。熱力学量を得るプログラムでの解析と併せて、この2段目の転移は1次の相転移ではないと考えられた。 さらに詳細な情報を得るため、SSI中の窒素を15Nで標識し、窒素と水素の2次元相関核磁気共鳴(NMR)測定をpH1.5で温度を変えて行った。この結果、D′状態では相当量の明確な3次構造が存在すること、この構造が20℃以上ではほぼ消滅することなどがわかり、CDの結果をさらに高い空間分解能で支持することができた。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 重点領域研究, 神戸大学, 1996年 - 1996年Osmolyteを利用したタンパク質の折りたたみ機構の解析まず、タンパク質SSIの構造形成機構を速度論的に探るため、pHジャンプ法をCDあるいはNMR測定を組み合わせて行った。実験条件としては4℃、pH5付近でSSIがnative構造が保持している状態から、pH1.5付近で低温変性後の特殊な3次構造(D′)をとる状態までのジャンプとした。これより、 1、CDによると。3次構造が一度かなり壊れてから序々にD′構造が形成されることがわかった。これは、native構造とD′構造のCDスペクトル上の交点で測定を行うことで精密に測定できた。 2、NMR法では、まずジャンプ直後、装置のdead timeに大きな構造転移があり、100秒かけてαヘリックスC端側にあるHis106やタンパク質内部にあるTrp86のシグナルが別の転移を示し、さらに320秒で最終的なD′構造となることがわかった。 また、SSI主鎖ププチド結合のNH水素の重水素交換反応を2次元NMR法により全シグナルを分離して観測することにより、βシート中でも部位によて異なるゆらぎを持っていることを明らかにした。この際、大腸菌による発現システムによって同位体標識を行ったSSIも用いた。 Osmolyteの効果は、まず安定性を熱測定によって調べた。この結果、最も効果の高かったsarcosineでは変性温度が10℃以上上昇し飛躍的に安定化に寄与することが明らかになった。ところが、変性の可逆性は逆減衰してしまい、平衡系として扱えないことがわかった。また、低温変性は、Osmolyteの添加によって0℃以上では明確に観測できないことがわかった。これらの結果は、Osmolyteが熱容量変化を減少させること、変性状態のタンパク質とも強く相互作用することを示唆するものである。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 一般研究(A), 神戸大学, 1993年 - 1995年タンパク質の非天然構造の研究1。x線溶液散乱等による蛋白質の変性状態の構造(赤坂、今野) (1)低温変性状態の構造 x線小角散乱、円二色性(CD)、NMRの3つの方法を総合的に用いることにより、蛋白質SSIの低温変性構造(D′)を天然構造(N)、熱変性構造(D)と比較し、それぞれの構造の特徴を明らかにした。 (2)蛋白質のメタノール変性状態の構造(赤坂、鎌足) Cytochrome c及びMyoglobinにおいて円二色性(CD)、蛍光、NMR、X線溶液散乱を用いて詳しく追跡し、一定のpHとメタノール濃度に依存してコンパクトな変性中間体(モルテングロビュール)が出現し、さらにメタノール濃度が上がると伸びた高ヘリックス状態が出現することを発見した。しかしLysozymeのように、コンパクトな変性中間体は出現せず、伸びた高ヘリックス状態のみが出現するものもあることも明らかとなった。 (3)ウレア溶液中でのStreptomyces Subtilisin Inhibitor(SSI)の変性構造 ウレア濃度に依存して、変性状態の構造が段階的にに変化することを明らかにした。 2。高圧下での蛋白質の立体構造及び圧力変性(赤坂) RibonucelaseAにおいて、高圧NMRの手法によって高圧下での変性に伴う熱力学関数の変化を算出した。これによって圧力変性における疎水効果が明らかになった。 3。温度シャンプNMRによる蛋白質アンフォールディングの過程(赤坂) 当研究室で開発したマイクロ波パルス温度ジャンプNMR装置を用いて、RibonucelaseAのアンフォールディングの中間体を検出した。 4。蛋白質フォールディングにおけるS-S結合の役割(橘) 遺伝子工学的手法により、4または2個のS-S結合を欠損した変異リゾチームを発現し、これを用いてフォールディング過程におけるS-S結合の役割について研究した。
- ペプチド結合切断活性を有する人工ペプチドおよびその利用特願2021- 062637, 2021年04月01日, 国立大学法人神戸大学特許権
- アミロイド分解能を有する人工ぺプチドおよびその利用特願2015-543878, 2014年10月22日, 大学長, 特許6455983, 2018年12月28日特許権
- レアメタル結合能を有する人工ペプチドおよびその利用(2)特願2013-182954, 2013年09月04日, 大学長, 特許6108549, 2017年03月17日特許権
- レアメタル結合能を有する人工ペプチドおよびその利用特願2012-047585, 2012年03月05日, 大学長, 特許5943463, 2016年06月03日特許権
- 金属イオン結合能およびナノチューブ形成能を有する環状ペプチドと、それを用いたペプチドで構成されるナノチューブ、並びにそれらの製造方法特願2006-053253, 2006年02月28日, 大学長, 特許4915986, 2012年02月03日特許権
- 導電性ペプチドナノファイバー及びその製造方法特願2004-308542, 2004年10月22日, 大学長, 特許4448949, 2010年02月05日特許権
- ナノファイバー形成能を有するペプチド、及びペプチドナノファイバー特願2004-151698, 2004年05月21日, 大学長, 特許4448947, 2010年02月05日特許権
- 導電性ペプチドナノファイバー及びその製造方法11/252719, 2005年10月19日, 大学長, 7449445, 2008年11月11日特許権
研究シーズ
■ 研究シーズ- 機能性ペプチドの人工設計シーズカテゴリ：ナノテク・材料, ライフサイエンス, 環境・農学研究キーワード：ペプチド, ナノ材料, ナノチューブ, レアメタル, 新型コロナウイルス研究の背景と目的：生体物質特有の高い選択性と効率性、自然素材で環境フレンドリーである点に着目し、新しい機能を持ったペプチドの設計を行っています。薬理作用や機能性材料など、望みの構造と機能を持ったペプチドを人工的に設計するものです。研究内容：新しい機能として、特定のレアメタルのみを選択的に結合し回収する、導電性を持つ、など、自然のタンパク質では達成できない新機能を創出することができます。また、新型コロナウイルスを抑える、アミロイド線維形成を阻害する、などの薬理作用をもたらす研究も進めています（JSTのプロジェクト等）。さらに、ペプチド分子を多数並べることで、ナノメートルサイズの分子集合体とするための設計を行い、ナノファイバーやナノチューブなどのユニークな形態を創り出し、その内部空間に機能性をもたらすことで、より高い機能や安定性をもたらすことにつなげています。
期待される効果や応用分野：・ レアメタル/レアアース（金、白金、パラジウム、ネオジムなど）のリサイクル分野 ・ ナノレベルでの配線技術 ・アミロイドーシスの治療を目指した創薬研究、医療機器の開発 ・新型コロナウイルスのスパイクタンパク質と相互作用し、発病を抑える関係する業績：①特許第4915986号：金属イオン結合能およびナノチューブ形成能を有する環状ペプチド (2012) ②特許第6108549号：レアメタル結合能を有する人工ペプチド(2017) ③特許第6455983号：アミロイド分解能を有する人工ぺプチド (2018) ④米国特許Patent No.7449445 CONDUCTIVE PEPTIDE (2008) ほか取得特許8件、出願特許17件
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kobe-u.ac.jp ※左記の「@」は画像ですので、ご利用の際はテキストの「@」を入力してください。
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