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原山 洋大学院農学研究科 資源生命科学専攻教授
研究者基本情報
■ 学位■ 研究キーワード
■ 研究分野
■ 委員歴
- - 現在, 精子研究会関西地区, 世話人
- - 現在, 関西アンドロロジーカンファレンス, 世話人
- - 現在, 関西生殖医学集談会, 世話人
- - 現在, Animal Science Journal, Section Editor of Reproduction/Embryo Manipulation (繁殖・胚操作部門 分野別統括編集委員)
- - 現在, Journal of Reproduction and Development, Editor-in-Chief (編集委員長）
- - 現在, 日本アンドロロジー学会, 理事
- - 現在, （公社）日本繁殖生物学会, 常務理事
- - 2025年06月, 日本アンドロロジー学会第44回学術大会 (2025年6月開催), 大会長
- - 2024年09月, 関西畜産学会, 評議員
- - 2024年06月, Reproductive Medicine and Biology, Editor (編集委員)
- - 2023年09月, 第116回日本繁殖生物学会大会・神戸大会 (2023年9月開催), 大会長
研究活動情報
■ 受賞- 2024年09月 Japanese Society of Animal Science, The 2024 Award for Excellence in Reviewing for Animal Science Journal in 2023, Animal Science Journal Reviewers Award
- 2021年04月 Japanese Society of Animal Science, The 2021 Award for Excellence in Reviewing for Animal Science Journal in 2020, Animal Science Journal Reviewers Award
- 2019年03月 Japanese Society of Animal Science, The 2019 Award for Excellence in Reviewing for Animal Science Journal in 2018, Animal Science Journal Reviewers Award日本国学会誌・学術雑誌による顕彰
- 2017年07月 日本学術振興会, 日本学術振興会（JSPS）平成28年度 特別研究員等審査会専門委員（書面担当）の表彰, 日本学術振興会（JSPS）平成28年度 特別研究員等審査会専門委員（書面担当）の表彰書面審査における有意義な審査意見を付した 専門委員として選ばれたため。, 日本国その他の賞
- 2012年09月 日本繁殖生物学会, 2012年度日本繁殖生物学会賞・学術賞, 哺乳類精子の細胞内cAMPシグナル伝達機構に関する研究繁殖生物学に関する基盤研究、応用研究等に顕著な功績があった。, 日本国国内学会・会議・シンポジウム等の賞
- 2006年08月 関西畜産学会, 第56回関西畜産学会優秀発表賞（第1位）, ブタ精子の頭部におけるcAMP依存性細胞内カルシウム濃度上昇に及ぼす炭酸水素ナトリウムおよびPKA阻害剤の影響日本国国内学会・会議・シンポジウム等の賞
- 2006年04月 American Society of Andrology, 2006 Lalor Foundation Award, Role of protein kinase C in the cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent hyperactivation of boar spermatozoaアメリカ合衆国国際学会・会議・シンポジウム等の賞
- 2025年02月, Journal of Reproduction and Development, 71(1) (1), 35 - 40, 英語Spermatic RXFP2 expression levels and seminal INSL3 concentrations among beef bull ejaculates with different levels of sperm morphological normality[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2023年06月, Journal of Reproduction and Development, 69(3) (3), 170 - 177, 英語Comparative characteristics between calyculin A-induced and thimerosal-induced hyperactivation of cryopreserved bovine spermatozoa[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2022年11月, Animal Science Journal, 93, e13777, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2022年06月, Journal of Reproduction and Development, 68(3) (3), 181 - 189, 英語Involvement of Ca2+-ATPase in suppressing the appearance of bovine helically motile spermatozoa with intense force prior to cryopreservation[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2021年04月, Animal Science Journal, 92(e13552) (e13552), 英語Calmodulin is involved in the occurrence of extracellular Ca2+-dependent full-type hyperactivation in boar ejaculated spermatozoa incubated with cyclic AMP analogs[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2020年09月, Theriogenology, 154, 100 - 109, 英語Effects of digoxin on full-type hyperactivation in bovine ejaculated spermatozoa with relatively lower survivability for incubation with stimulators of cAMP signaling cascades[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2020年08月, Animal Reproduction Science, 218(106479) (106479), 英語Characteristics of bull sperm acrosome associated 1 proteins[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2019年04月, Theriogenology, 129, 46 - 53, 英語Identification of isoforms of calyculin A-sensitive protein phosphatases which suppress full-type hyperactivation in bull ejaculated spermatozoa[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2018年10月, Reproductive Medicine and Biology, 17(4) (4), 442 - 448, 英語Flagellar hyperactivation of bull and boar spermatozoa [Invited review article][査読有り][招待有り]
- 2018年10月, Journal of Reproduction and Development, 64(5) (5), 377 - 384, 英語Reconsideration of the evaluation criteria for bull ejaculated sperm motility in the context of rotation[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Ejaculated boar spermatozoa exhibit two types of hyperactivation: full and non-full. Full-type hyperactivation is characterized by the asymmetrical bending of the entire middle piece-principal piece and a twisting/figure-eight-like trajectory, and can be induced by simple incubation with CaCl2 after preincubation with a cAMP analog (Sp-5,6-dichloro-1--D-ribofuranosyl-benzimidazole-3,5-cyclic monophosphorothioate [cBiMPS]). Here, we compared the sperm flagellar motility after treatments with elevators of [Ca2+](i) (cBiMPS/CaCl2, thimerosal, procaine, and 4-aminopyridine) to characterize the regulatory mechanism of extracellular Ca2+-dependent, full-type hyperactivation in ejaculated boar spermatozoa, and examined the possible involvement of Transient receptor potential cation channel subfamily C member 3 (TRPC3) in this event using the specific inhibitor Pyr3. Full-type hyperactivation was induced by a 60-min incubation with CaCl2 following a 180-min preincubation with cBiMPS but without Ca2+. Thimerosal-treated spermatozoa exhibited full-type hyperactivation in a manner independent of extracellular Ca2+; conversely, this was not observed in procaine- or 4-aminopyridine-treated spermatozoa. A 20-min treatment with Pyr3 between preincubation with cBiMPS and incubation with CaCl2, significantly suppressed the normal phenotype. These observations indicated that mechanisms underlying full-type hyperactivation in spermatozoa incubated with CaCl2 after preincubation with cBiMPS are different from those in the thimerosal-treated spermatozoa. Furthermore, indirect immunofluorescence localized TRPC3 in the upper segment of the middle piece, which bends asymmetrically during full-type hyperactivation but not in non-full-type hyperactivation, suggesting that TRPC3 may be involved in the extracellular Ca2+-dependent full-type hyperactivation in ejaculated boar spermatozoa.WILEY, 2017年11月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 84(11) (11), 1203 - 1217, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2017年09月, 日本胚移植学雑誌, 39(3) (3), 159 - 167, 日本語家畜精子鞭毛の超活性化運動に関する研究の現状 [招待総説論文][査読有り][招待有り]研究論文（学術雑誌）
- 2017年04月, Reproductive Medicine and Biology, 16(2) (2), 89 - 98Protein biomarkers for male artificial insemination subfertility in bovine spermatozoa [Invited review article][査読有り][招待有り]
- In Japanese black cattle, AI severely subfertile males have occasionally been found. In order to solve this problem, we previously asserted the need for exact examinations of acrosomal tyrosine-phosphorylated proteins and acrosome morphology in cryopreserved spermatozoa. In the present study, we further investigated acrosomal tyrosine-phosphorylated proteins in spermatozoa before cryopreservation and examined possible relationships between these phosphoproteins and acrosome stability. Ejaculated, epididymal and cryopreserved spermatozoa were subjected to examinations of general characteristics (motility, shape and acrosome morphology) and indirect immunofluorescence of acrosomal phosphoproteins. Unlike all general characteristic parameters, the distribution of acrosomal tyrosine-phosphorylated proteins in ejaculated and cauda epididymal spermatozoa varied considerably among bulls and was linked to the maintenance of morphologically normal acrosomes in cryopreserved spermatozoa or ejaculated spermatozoa after 270min incubation. Moreover, the distribution of these phosphoproteins was arranged in the spermatozoa of the proximal epididymides. These findings indicate that acrosomal tyrosine-phosphorylated proteins are distributionally arranged during early process of sperm maturation, that their distribution of cauda epididymal and ejaculated spermatozoa are largely different among bulls, and that varied states of acrosomal phosphoproteins may result in individual differences in acrosome stability among bulls.CSIRO, 2017年, Reproduction, Fertility and Development, 29(7) (7), 1297 - 1305, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- To obtain basic information of bull IZUMOI (a sperm protein essential for sperm-egg fusion) and disclose possible causes for the impaired fertilizing ability in bull cryopreserved spermatozoa, we investigated this protein in bull spermatozoa collected from various regions of epididymides, freshly ejaculated spermatozoa, acrosome-reacted spermatozoa, and cryopreserved spermatozoa by Western blotting and the triple staining with the anti-IZUMO1 antibody, fluorescein isothiocyanate-peanut agglutinin, and 4',6-diamidino-2-phenylindole. In the cauda epididymal spermatozoa and freshly ejaculated spermatozoa, bull IZUMOI was detected mainly as a 45-kDa major form. This major form was derived probably from a 52-kDa precursor form in the epididymis. Bull IZUMOI was immunolocalized along the border between the principal and equatorial segments of the acrosomal region (pattern P1 of IZUMOI) in the most of epididymal and freshly ejaculated spermatozoa with normal acrosomes. In the samples after the treatments to induce the acrosome reaction, the percentages of spermatozoa without acrosomes and with IZUMOI in whole equatorial segment (pattern P2 of IZUMOI) significantly increased. These results indicate that bull IZUMOI undergoes maturation-related changes during sperm transit through the epididymis and that it is translocated to the equatorial segment of acrosomal region during the acrosome reaction. On the other hand, severe damages were observed in the acrosomes of 60% of the cryopreserved spermatozoa. Localization of IZUMOI in these spermatozoa was pattern P2 (IZUMOI in whole equatorial segment), P3 (IZUMOI in whole acrosomal region), or P4 (IZUMO was lost). Moreover, after the incubation to compare the stability of acrosomes and IZUMOI localization between cryopreserved spermatozoa and freshly ejaculated spermatozoa, much more spermatozoa lost acrosomes and IZUM01 in the cryopreserved samples compared with freshly ejaculated samples. These findings indicate that impaired fertilizing ability of bull cryopreserved spermatozoa with damaged acrosomes is related partially to the aberrant translocation of IZUMO1 which may be followed by the loss of intact IZUMOI. (C) 2016 Elsevier Inc. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE INC, 2016年12月, THERIOGENOLOGY, 86(9) (9), 2179 - 2188, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The aims of this study were to show the existence of individual differences in the distribution of sperm acrosome-associated 1 (SPACA1) among male patients of infertile couples and to examine their possible impact on the outcomes of conventional in vitro fertilization (IVF). The spermatozoa were collected from male patients of infertile couples, washed by centrifugation, collected by the swim-up method, and then used for clinical treatments of conventional IVF. The surplus sperm samples were fixed and stained with an anti-SPACA1 polyclonal antibody for the immunocytochemistry. In the clinical IVF treatments, fertilization rates and blastocyst development rates were evaluated. The immunocytochemical observations revealed that SPACA1 were localized definitely in the acrosomal equatorial segment and variedly in the acrosomal principal segment. Specifically, the detection patterns of SPACA1 in the acrosomal principal segment could be classified into three categories: (A) strong, (B) intermediate or faint, and (C) almost no immunofluorescence. The SPACA1 indexes were largely different among male patients with the wide range from 13 to 199 points. The SPACA1 indexes were significantly correlated with developmental rates of embryos to blastocysts (r = 0.829, P = 0.00162), although they were barely associated with fertilization rates at 19 h after insemination (r = 0.289, P = 0.389). These results suggest that the distribution of SPACA1 in sperm affects the outcomes of conventional IVF. In conclusion, this study provides initial data to promote large-scale clinical investigation to demonstrate that the SPACA1 indexes are valid as molecular biomarkers that can predict the effectiveness of conventional IVF of infertile couples.CAMBRIDGE UNIV PRESS, 2016年10月, ZYGOTE, 24(5) (5), 654 - 661, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The aims of this study were to investigate changes in the distribution and molecular mass of boar sperm acrosome-associated 1 (SPACA1) proteins during the acrosome reaction and to discuss validity of SPACA1 proteins as indicators for occurrence of the true acrosome reaction. Boar ejaculated spermatozoa were used for induction of the extracellular Ca2+-dependent acrosome reaction (true acrosome reaction) or acrosomal damages (false acrosome reaction) and then subjected to double staining with the anti-SPACA1 protein antibody and FITC-PNA and Western blotting. Extracellular Ca2+-dependently acrosome-reacted spermatozoa were characterized by appearance of SPACA1 proteins in the postacrosomal region (; these spermatozoa were classified into SP-3&AR pattern of double staining). However, SPACA1 proteins were not observed in the postacrosomal region of frozen-thawed spermatozoa with severely damaged acrosomes (; these spermatozoa were classified into SP-2&AR pattern). Moreover, the spermatozoa in which acrosomes were severely damaged by incubation with cyclodextrins and without CaCl2 were classified into either SP-2&AR or SP-3&AR pattern. Although SPACA1 proteins were detected mainly as 36-42 kDa proteins in the spermatozoa with intact acrosomes, small types of SPACA1 proteins (15-28 kDa) increased in extracellular Ca2+-dependently acrosome-reacted spermatozoa as well as frozen-thawed spermatozoa with damaged acrosomes. These results show the increase of boar spermatozoa classified into SP-3&AR pattern after incubation in the medium with CaCl2 and without cyclodextrins indicates occurrence of the true acrosome reaction. Moreover, we suggest the increase of small types of SPACA1 proteins is a valid indicator for occurrence of the acrosomal disintegration arising from the true and false acrosome reactions. (C) 2016 Elsevier B.V. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE BV, 2016年09月, ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE, 172(1) (1), 94 - 104, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- We previously suggested that protein phosphatase-dependent decrease of postacrosomal phosphorylated proteins may be necessary for the occurrence of acrosome reaction in livestock spermatozoa (Adachi et al., J Reprod Dev 54, 171-176, 2008; Mizuno et al., Mol Reprod Dev 82, 232-250, 2015). The aim of this study was to examine the involvement of the intracellular cAMP signaling cascades in the regulation of the decrease of postacrosomal phosphorylated proteins in boar spermatozoa. Boar ejaculated spermatozoa were incubated with CAMP analogs and then used for the immunodetection of serine/threonine-phosphorylated proteins and assessment of acrosome morphology. The protein phosphatase-dependent decrease of postacrosomal phosphorylated proteins was greatly promoted by the incubation with a cAMP analog Sp-5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole-3',5'-monophosphorothioate (cBiMPS). This decrease was induced before the initiation of acrosome reaction and did not require the millimolar concentration of extracellular Ca2+ which was necessary for the initiation of acrosome reaction. Moreover, suppression of protein kinase A activity with an inhibitor (H89) had almost no influence on both decrease of phosphorylated proteins and occurrence of acrosome reaction in the spermatozoa incubated with cBiMPS. In addition, the prolonged incubation with a potentially exchange protein directly activated by cAMP-selective cAMP analog (8pM) could only partially mimic effects of cBiMPS on these events. These results indicate that the CAMP-dependent signaling cascades which are less dependent on protein kinase A may regulate the decrease of postacrosomal phosphorylated proteins in boar spermatozoa before the extracellular Ca2+-triggered initiation of acrosome reaction. (C) 2016 Elsevier Inc. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE INC, 2016年04月, THERIOGENOLOGY, 85(6) (6), 1152 - 1160, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Effects of acrosomal conditions of frozen-thawed spermatozoa on the results of artificial insemination in Japanese Black cattleThe purposes of this study were to examine the relationship between male artificial insemination (AI) fertility and sperm acrosomal conditions assessed by new and conventional staining techniques and to identify possible reproductive dysfunctions causing low conception rates in AT using frozen-thawed spermatozoa with poor acrosomal conditions in Japanese Black bulls. We investigated individual differences among bulls in the results concerning (1) acrosomal conditions of frozen-thawed spermatozoa as assessed by not merely peanut agglutinin-lectin staining (a conventional staining technique) but also immunostaining of acrosomal tyrosine-phosphorylated proteins (a new staining technique), (2) routine AI using frozen-thawed spermatozoa as assessed by pregnancy diagnosis, (3) in vivo fertilization of frozen-thawed spermatozoa and early development of fertilized eggs as assessed by superovulation/AI-embryo collection tests and (4) in vitro fertilization of frozen-thawed spermatozoa with oocytes. The percentages of frozen-thawed spermatozoa with normal acrosomal conditions assessed by the abovementioned staining techniques were significantly correlated with the conception rates of routine AI, rates of transferable embryos in superovulation/AI-embryo collection tests and in vitro fertilization rates. These results are consistent with new suggestions that the distribution of acrosomal tyrosine-phosphorylated proteins as well as the acrosomal morphology of frozen-thawed spermatozoa are AI fertility-associated markers that are valid for the prediction of AI results and that low conception rates in AI using frozen-thawed spermatozoa with poor acrosomal conditions result from reproductive dysfunctions in the processes between sperm insemination into females and early embryo development, probably failed fertilization of frozen-thawed spermatozoa with oocytes.SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD, 2015年12月, JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 61(6) (6), 519 - 524, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- There are species differences in the regulatory system for sperm capacitation and subsequent hyperactivation between livestock and laboratory animals. In livestock spermatozoa, it is poorly understood when and how extracellular Ca2+ is necessary for hyperactivation, although it has been demonstrated that the [Ca2+](i) increase is indispensable to occurrence of hyperactivation. In this study, we examined necessity of extracellular Ca2+ for the initiation and maintenance of hyperactivation and then sought possible target molecule of Ca2+ that was involved in hyperactivation of boar spermatozoa. Boar ejaculated spermatozoa were pre-incubated with a cell-permeable cyclic adenosine monophosphate (cAMP) analog cBiMPS' and without CaCl2 to induce the cAMP-triggered events including capacitation-associated changes. Subsequently, they were incubated with CaCl2 to induce hyperactivation and then used for motility assessment. Many of the spermatozoa after the incubation exhibited full-type hyperactivation which was characterized by high-amplitude and extremely asymmetrical beating of whole middle piece and principal piece. The initiation of full-type hyperactivation required the millimolar concentration of CaCl2 in the medium. However, CaCl2 of the medium was less necessary for maintenance than initiation of full-type hyperactivation, as hyperactivated spermatozoa were barely affected by the incubation with the Ca2+-chelating reagent. On the other hand, the pre-treatment with the inhibitor for Ca2+-dependent protease calpain 1 and 2' clearly suppressed the occurrence of CaCl2-induced hyperactivation without influences on the percentages of motile spermatozoa. Western blotting and indirect immunofluorescence showed distribution of calpain 2 in the middle and principal pieces in which full-type hyperactivated spermatozoa exhibited extremely asymmetrical beating. On the basis of these results, we conclude that the millimolar concentration of extracellular Ca2+ is necessary for the initiation, but not for the maintenance of full-type hyperactivation in boar spermatozoa that beforehand undergo the cAMP-triggered events including capacitation-associated changes. Moreover, we suggest possible involvement of calpain 2 in the intracellular Ca2+ signal transduction leading to full-type hyperactivation.WILEY, 2015年03月, ANDROLOGY, 3(2) (2), 321 - 331, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Livestock spermatozoa possess more tenacious suppressors of cAMP-triggered eventsincluding capacitation-associated changesthan laboratory animal spermatozoa, leading to flagellar hyperactivation. In order to identify the suppressors, we examined effects of an inhibitor of serine/threonine protein phosphatases (calyculin A) on cAMP-triggered changes in the protein phosphorylation state, and subsequent occurrence of hyperactivation and acrosome reaction in ejaculated bull spermatozoa. Ejaculated spermatozoa were incubated in cAMP-supplemented medium, then assessed for motility, acrosome morphology, and phosphorylated protein localization. The addition of calyculin A greatly enhanced cAMP-triggered protein phosphorylation at serine/threonine and tyrosine residues in the connecting piece and induction of flagellar hyperactivation. Most hyperactivated spermatozoa exhibited extremely asymmetrical bends at the middle piece, which produced intensive twisting or figure-eight movements. In the sperm head, however, cAMP-triggered dephosphorylation of serine/threonine-phosphorylated proteins and subsequent acrosome reaction were abolished by the addition of calyculin A. Based on these results, we suggest that calyculin A-sensitive protein phosphatases in the connecting piece are suppressors of cAMP-triggered events leading to hyperactivation. By contrast, similar protein phosphatases in the sperm head accelerate cAMP-triggered events leading to the acrosome reaction. These findings are consistent with the indication that calyculin A-sensitive protein phosphatases have distinct functions in the regulation of cAMP-triggered events in different regions of ejaculated bull spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 82: 232-250, 2015. (c) 2015 Wiley Periodicals, Inc.WILEY, 2015年03月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 82(3) (3), 232 - 250, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The characterization and quantitative analyses of the key transcription factors for spermiogenesis are necessary in the identification of causal factors for the production of the seemingly normal sperm with dysfunctions in Japanese Black bulls and further elucidation of whole aspect of molecular mechanisms for spermiogenesis in livestock. The objective of this study was to obtain the information regarding the characterization and individual changes of an activator cAMP-responsive element modulator (CREM), which is necessary to the normal progress of spermiogenesis and is required for the transcriptional activity of genes coding essential factors for the sperm fertilization ability in rodents, using testes from 21 Japanese Black bulls with the ability to produce sperm indicating the normal motility and morphology. The bull CREM Tay (one of activator variants) was detected in testes more strongly than livers by reverse transcription-polymerase chain reaction and Northern blotting. This variant was localized in the nuclei of spermatids as shown by indirect immunofluorescence with the homemade mouse antiserum. The motility and morphology of the cauda epididymal sperm from 16 Japanese Black bulls were examined before the quantitative analyses of testicular activator CREM to confirm the ability to produce sperm with normal motility and morphology in these males. The percentages of the motile sperm, those of the sperm with the normal acrosomes, and those of morphologically normal sperm were 60.0% to 90.0%, 88.0% to 100%, and 83.0% to 97.9%, respectively. The quantitative analyses with real-time polymerase chain reaction using the testicular RNA from the same bulls revealed that the relative expression levels of activator CREM variants in testes varied significantly among these bulls in the range from 0.56 to 1.64 (P < 0.05). These results are consistent with the suggestions that CREM Tay are involved in the spermiogenesis in the testes of Japanese Black bulls and that the expression levels of the activator CREM variant mRNAs in the testes are varied significantly among individual bulls that have the ability to produce sperm with the normal motility and morphology. (c) 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE INC, 2014年05月, THERIOGENOLOGY, 81(8) (8), 1012 - 1020, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2013年10月, Journal of Reproduction and Development, 59(5) (5), 421 - 430, 英語Roles of intracellular cyclic AMP signal transduction in the capacitation and subsequent hyperactivation of mouse and boar spermatozoa [Invited review article][査読有り][招待有り]研究論文（学術雑誌）
- There is a serious problem with the reduction of male reproductive performance of the livestock in the world. We have a hypothesis that the splicing error-caused derivation of aberrant sperm motility-related proteins may be one of its causal factors. It is thought that fresh testicular tissues are necessary for the detection of splicing errors of the mRNA. However, it is difficult to obtain testicular tissues from a number of agriculturally important bulls by surgical methods, because such procedures may have deleterious effects on bulls' reproductive performance. The aim of this study was to examine the usefulness of mRNA fragments collected from ejaculated spermatozoa as alternative analytical samples for detection of the splicing errors. In the first experiment, we characterized the alternative splicing and splicing error of bull testicular ADCY10 mRNA which coded the synthase of the regulatory molecule for sperm motility "cAMP". In testes, the exon 11-lacking variant coding the truncated ADCY10 was derived by alternative splicing. However, splicing errors, which accompanied the frame shift in the second cyclase domain, were occasionally observed in the exon 11-lacking variant. This aberrant variant retained intronic nucleotides (4 bases, CCAG) connecting the initial part of exon 10 due to splicing errors and consequently yielded the cleavage site for a restriction enzyme (Cac8I) which recognized the nucleotide sequences (GCNNGC). In the second experiment, we recovered residual testicular mRNA fragments from ejaculated spermatozoa and observed the splicing error-caused derivation of the aberrant variant of ADCY 10. Ejaculated spermatozoa conserved mRNA fragments of the exon 11-lacking variant coding exons 9, 10, 12 and 13. Moreover, the above-mentioned aberrant variant of ADCY10 mRNA fragment was detectable by Cac8I digestion treatment using the sperm mRNAs. These results indicate the utility of sperm mRNA fragments for the detection of splicing errors in bull testicular mRNAs.PUBLIC LIBRARY SCIENCE, 2013年02月, PLOS ONE, 8(2) (2), e57296, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- In mammalian spermatozoa, the state of protein tyrosine phosphorylation is modulated by protein tyrosine kinases and protein tyrosine phosphatases that are controlled via cyclic AMP (cAMP)-protein kinase A (PKA) signaling cascades. The aims of this study were to examine the involvement of cAMP-induced protein tyrosine phosphorylation in response to extracellular calcium and to characterize effects of pharmacological modulation of the cAMP-induced protein phosphorylation state and calmodulin activity during hyperactivation in boar spermatozoa. Ejaculated spermatozoa were incubated with cBiMPS (a cell-permeable cAMP analog) and CaCl2 at 38.5 degrees C to induce hyperactivation, and then used for Western blotting and indirect immunofluorescence of phosphorylated proteins and for the assessment of motility. Both cBiMPS and CaCl2 were necessary for hyperactivation. The increase in hyperactivated spermatozoa exhibited a dependence on the state of cBiMPS-induced protein tyrosine phosphorylation in the connecting and principal pieces. The addition of calyculin A (an inhibitor for protein phosphatases 1/2A (PP1/PP2A), 50100?nM) coincidently promoted hyperactivation and cAMP-induced protein tyrosine phosphorylation in the presence of cBiMPS and CaCl2. Moreover, the addition of W-7 (a calmodulin antagonist, 24 mu M) enhanced the percentages of hyperactivated spermatozoa after incubation with cBiMPS and CaCl2, independently of protein tyrosine phosphorylation. These findings indicate that cAMP-induced protein tyrosine phosphorylation in the connecting and principal pieces is involved in hyperactivation in response to extracellular calcium, and that calmodulin may suppress hyperactivation via the signaling cascades that are independent of cAMP-induced protein tyrosine phosphorylation. Mol. Reprod. Dev. 79: 727739, 2012. (C) 2012 Wiley Periodicals, Inc.WILEY-BLACKWELL, 2012年10月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 79(10) (10), 727 - 739, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- It is necessary to obtain basic information on transcription factors expressed in the spermatids of livestock to determine mechanisms of defective spermiogenesis. In this study, we characterized the activator cAMP responsive element modulator (CREM) ortholog isoforms in porcine testicular germ cells and ejaculated sperm. At least two kinds of porcine activator CREM T family ortholog mRNAs were more strongly expressed in the testis than in kidney or liver. The activator CREM isoform ortholog proteins were localized in nuclei of round spermatids and around nuclei of elongated spermatids. Furthermore, approximately 34% of ejaculated sperm had the activator CREM isoform ortholog proteins at their connecting piece. This is apparently the first report demonstrating the expression and localization of the activator CREM isoform ortholog proteins in spermatids and ejaculated sperm of a livestock species. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE INC, 2012年04月, THERIOGENOLOGY, 77(7) (7), 1360 - 1368, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Purpose: We studied the effect of H89, an inhibitor of protein kinase A (PKA), on the meiotic resumption of pig oocytes. Methods: Pig cumulus-oocyte complexes (COCs) and denuded oocytes (DOs) were cultured for 27 h to induce meiotic resumption. COCs and DOs were exposed to H89 for different periods. Oocyte PKA activity was assessed by in vitro kinase assay and immunocytochemistry using an antibody against fully active PKA catalytic subunits. Oocyte serine/threonine (Ser/Thr)-phosphorylated proteins were detected by Western blotting and immunocytochemistry using an anti-pSer/pThr PKA substrate antibody. Results: H89 suppressed germinal vesicle break down (GVBD) in COCs and DOs. To determine whether the suppression was due to inhibition of oocyte PKA, we analyzed oocyte PKA. Kinase assay showed that both types of oocytes possessed PKA activity throughout the culture period. Immunocytochemistry showed that fully active PKA catalytic subunits and Ser/Thr phosphorylated proteins were present in the oocytes at the GV stage and after GVBD. Western blotting indicated that both types of oocytes contained Ser/Thr phosphorylated proteins at the GV stage, and that several proteins became phosphorylated after GVBD. Conclusions: Pig oocytes contain active PKA during the occurrence of GVBD, and H89 suppresses the GVBD. © 2011 Japan Society for Reproductive Medicine.John Wiley and Sons Ltd, 2011年, Reproductive Medicine and Biology, 10(2) (2), 89 - 96, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The aim of this study was to elucidate the relationship between protein tyrosine phosphorylation state and sperm characteristics in frozen-stored spermatozoa of Japanese Black bulls. The spermatozoa were washed with PBS containing polyvinyl alcohol and then incubated with cell-permeable cAMP analog cBiMPS to induce flagellar hyperactivation. Before and after incubation, the spermatozoa were used for immunodetection of tyrosine-phosphorylated proteins, assessment of morphological acrosome condition and evaluation of motility. In bulls whose frozen-stored spermatozoa were classified as having a high-grade acrosome condition before incubation, sperm tyrosine-phosphorylated proteins, including the 33-kDa tyrosine-phosphorylated SPACA1 protein, were localized in the anterior region of the acrosome and equatorial subsegment. The immunodetection level of the 41- and 33-kDa sperm tyrosine-phosphorylated proteins in the Western blots and the immunofluorescence of tyrosine-phosphorylated proteins and SPACA1 proteins in the anterior region of the sperm acrosome were lower in bulls whose frozen-stored sperm were classified as having a low-grade acrosome condition. On the other hand, after incubation with cBiMPS, immunodetection levels of at least 10 tyrosine-phosphorylated proteins increased in the connecting and principal pieces of spermatozoa, coincident with the induction of flagellar hyperactivation. Many of the spermatozoa also exhibited detection patterns similar to those of boar hyperactivated spermatozoa. These results are consistent with the suggestion that immunodetection levels of tyrosine-phosphorylated proteins are valid markers that can predict the level of tolerance to frozen storage and the potential to undergo cAMP-dependent hyperactivation for the spermatozoa of individual Japanese Black bulls.WILEY-LISS, 2010年10月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 77(10) (10), 910 - 921, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Evidence of the Existence of Adenylyl Cyclase 10 (ADCY10) Ortholog Proteins in the Heads and Connecting Pieces of Boar SpermatozoaThe aim of this study is to provide evidence of the existence of the adenylyl cyclase 10 (ADCY-10) ortholog proteins in boar spermatozoa. Experiments with RT-PCR techniques, nucleotide sequence analyses and Northern blot analyses revealed that boar testes exclusively express approximately 5.1-kbp RNA, the nucleotide sequence of which is highly similar to that of human A DCY10. Database analyses with CDART suggested that pig ADCY10 ortholog proteins conserve two catalytic domains of adenylyl cyclase. Western blot techniques and indirect immunofluorescence with a specific antiserum to pig recombinant ADCY10 ortholog proteins showed that 48-kDa and 70-kDa truncated forms of pig ADCY10 ortholog proteins are localized in the equatorial segments and connecting pieces of boar ejaculated spermatozoa. Finally, cell imaging techniques with fluo-3/AM indicated that incubation with sodium bicarbonate (an ADCY10 activator) can initiate the calcium influx in the boar sperm heads that is controlled via the cyclic AMP signaling cascades. These results are consistent with the suggestion that functional ADCY10 ortholog proteins exist in the heads of boar spermatozoa. This is the first direct evidence of the existence of ADCY10 proteins in the heads of mammalian spermatozoa.SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD, 2010年04月, JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 56(2) (2), 271 - 278, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Hyperactivated Motility of Frozen-Thawed Spermatozoa from Fertile and Subfertile Japanese Black Bulls Induced by Cyclic Adenosine 3 ',5 '-Monophosphate Analogue, cBiMPSThis study investigated whether a cyclic adenosine 3',5'-monopliosphate (cAMP) analogue, cBiMPS, could induce hyperactivated motility in frozen-thawed Japanese Black bull spermatozoa and compared the ability of spermatozoa to undergo hyperactivation between fertile and subfertile bulls. Frozen-thawed spermatozoa from 3 fertile and 2 subfertile bulls were washed, suspended in BO-Hepes medium and incubated in the presence of 0.1 mM cBiMPS for up to 4 h. At 1-h intervals, the spermatozoa were examined for hyperactivated motility. The proportions of spermatozoa showing a circular swimming pattern with asymmetrical flagellar beating and those showing whiplash beating of flagella to the total number of motile spermatozoa were expressed as C% and W%, respectively. The motile spermatozoa % was barely affected by treatment with cBiMPS or the fertility status of the sperm donor, although it gradually decreased in all sperm samples during the 4-h incubation. In the fertile bulls, the C% was 0% at 0 h of incubation but rapidly increased during the 1-h incubation with cBiMPS. It then decreased slightly towards 4 h concomitantly with a gradual increase in W% towards 4 h. In the subfertile bulls, however, the cBiMPS-induced increase of C%. was delayed for 1-3 h, although the incubation time-related changes in mean W% were similar between the fertile and subfertile bulls. In the vehicle controls for cBiMPS, the C% and W% were 0% throughout incubation for all the samples examined. The results suggest that hyperactivation of the flagellum can be induced by the cAMP analogue, cBiMPS, in frozen-thawed Japanese Black bull spermatozoa and that induction of hyperactivation may serve as a useful tool for detection of functional abnormality of spermatozoa from subfertile Japanese Black bulls.SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD, 2010年02月, JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 56(1) (1), 36 - 40, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Recent animal experiments confirmed that paternal 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) exposure decreases the sex ratio of offspring at birth without altering litter size. However, the timing of this decrease remained unclear. Male mice were administered TCDD at 7-12 weeks of age and mated with non-treated females. The Y-bearing/X-bearing sperm ratio was examined by real-time PCR and FISH methods, and the sex ratio of the 2-cell embryos collected from non-treated females that had been mated with TCDD-exposed males were investigated by nested PCR. The Y-bearing/X-bearing sperm ratio was not significantly decreased in the TCDD group. However, the sex ratio of the 2-cell embryos of the TCDD group was significantly lower than that of the control group. These results may have resulted from a decrease in fertility of Y-bearing sperm. Thus, the results of this study suggested that the sex ratio of the offspring was decreased at fertilization and not during the spermatozoa stage. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.PERGAMON-ELSEVIER SCIENCE LTD, 2010年01月, REPRODUCTIVE TOXICOLOGY, 29(1) (1), 68 - 73, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Calyculin A-Sensitive Protein Phosphatases are Involved in Maintenance of Progressive Movement in Mouse Spermatozoa In Vitro by Suppression of Autophosphorylation of Protein Kinase AProtein serine/threonine phosphorylation in mammalian sperm flagella has been considered to play important roles in regulation of motility. Protein phosphorylation state reflects balance of enzymatic activities between protein phosphatases and protein kinases [predominantly protein kinase A (PKA)]. The aims of this study were to disclose roles of protein phosphatases in the regulation of sperm motility and to provide evidence for suppression of PKA full activation by protein phosphatases in sperm flagella. Mouse epididymal spermatozoa were incubated with a cell-permeable protein phosphatase 1. (PP1)/protein phosphatase 2A (PP2A) inhibitor (calyculin A: 25-125 nM) at 37.5 C. After incubation, they were used for immunodetection of phosphorylated proteins, PKA and PP1 gamma 2, assessment for motility and co-immunoprecipitation of PP1 gamma 2 with PKA. Incubation with calyculin A enhanced the phosphorylation states of several proteins (>250 kDa, 1.70 kDa, 155 kDa, 140 kDa and 42 kDa for serine/threonine phosphorylation and 70 kDa for tyrosine phosphorylation) and PKA catalytic subunits [at the autophosphorylation residue (Thr-197) for its full enzymatic activation] in the flagella. Coincidently, this incubation induced changes of sperm flagellar movement from the progressive type to the hyperactivation-like type. Indirect immunofluorescence and co-immunoprecipitation showed that PKA was co-localized with PP1 gamma 2 in the principal pieces of sperm flagella. These findings suggest that calyculin A-sensitive protein phosphatases (PP1/PP2A) suppress full activation of PKA as well as enhancement of the phosphorylation states of other flagellar proteins in sperm flagella in order to prevent precocious changes of flagellar movement from the progressive type to hyperactivation.SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD, 2009年06月, JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 55(3) (3), 327 - 334, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- A 32-kDa Tyrosine-phosphorylated Protein Shows a Protease-dependent Increase in Dead Boar SpermatozoaBoar sperm TyrP32 is a 32-kDa tyrosine-phosphorylated protein that increases during the capacitation and acrosome reaction and during cryocapacitation. However, it is Still unclear whether the increase in TyrP32 is an event that is limited to the process of sperm fertilization, including crvocapacitation. The aims of the present study were to demonstrate that TyrP32 is increased in dead spermatozoa after freeze-thawing without a cryoprotectant and to find the causal factors for this increase. Washed spermatozoa were resuspended in a salt solution and then frozen. The frozen samples were rapidly thawed in a warm water bath and then used for sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)/Western blotting to detect TyrP32, SDS-PAGE/silver staining of sperm proteins and staining of acrosomal contents with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated peanut agglutinin (PNA). In the samples before freezing, TyrP32 was barely detectable, and the distribution of the acrosomal contents was normal in most spermatozoa. One cycle of freeze-thawing induced an increase in TyrP32, a decrease in major sperm proteins and disorder in the acrosomal contents. However, the addition of a protease inhibitor (APMSF, 1 mM) suppressed the increase in TvrP32 and the decrease in the major sperm proteins, although it did not have any influence on the disorder in the acrosomal contents. Additionally, the spermatozoa did not exhibit any flagellar movement after freeze-thawing, which showed that almost all of them were dead. These results indicate that TyrP32 call show a protease-dependent increase in dead spermatozoa after freeze-thawing without a cryoprotectant even though the dead spermatozoa do not undergo cryocapacitation.SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD, 2008年12月, JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 54(6) (6), 502 - 507, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- A cAMP-induced protein tyrosine phosphorylation and flagellar hyperactivation are controlled via complicated signaling cascades in mammalian spermatozoa. For instance, these events seem to be regulated positively by the PKA-mediated signaling and negatively by the PI3K/PDK1 -mediated signaling. In this article, we have shown molecular changes of PKA and PDK1 in cAMP analog (cBiMPS)-treated boar spermatozoa in order to disclose possible roles of these kinases in protein tyrosine phosphorylation and hyperactivation. Ejaculated spermatozoa were incubated with cBiMPS, and then they were used for biochemical analyses of sperm kinases by Western blotting and indirect immunofluorescence and for assessment of flagellar movement. The first 30-min incubation with cBiMPS highly activated PKA of the principal piece to the accompaniment of autophosphorylation on Thr-197 of catalytic subunits. However, protein tyrosine phosphorylation and hyperactivation were fully induced in the sperm samples after the 180-min incubation. A potentially active form of PDK1 (54/55-kDa phospho-PDK1) was detected in the principal piece of the spermatozoa during the 90-min incubation. Another potentially active form (59-kDa phospho-PDK1) gradually increased during the same incubation period. However, the PDK1 suddenly became inactive by the dephosphorylation after the 180-min incubation, namely coincidently with full induction of protein tyrosine phosphorylation and hyperactivation. Additionally, existence of POK-dependently suppressing mechanisms for protein tyrosine phosphorylation was confirmed in the principal piece by pharmacological experiments with LY294002 and biochemical analyses with anti-PI3K p85 antibodies. These findings suggest that dephosphorylation of PDK1 may be a molecular switch for enhancement of protein tyrosine phosphorylation and flagellar hyperactivation in boar spermatozoa.WILEY-BLACKWELL, 2008年09月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 75(9) (9), 1396 - 1407, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Effects of protein phosphatase inhibitor calyculin a on the postacrosomal protein serine/threonine phosphorylation state and acrosome reaction in bear spermatozoa incubated with a cAMP analogIn order to reveal the involvement of the sperm postacrosomal region in the acrosome reaction, we examined the effects of the protein phosphatase inhibitor calyculin A on the postacrosomal protein serine/threonine phosphorylation state and acrosorne morphology in boar spermatozoa incubated with a cAMP analog. Proteins were highly phosphorylated on the serine/threonine residues only in the postacrosomal region before incubation. After 90-min incubation. without calyculin A, the protein phosphorylation state declined in the postacrosomal region irrespective of the capacitation state while it remained under the detectable level in the other regions of the sperm head. However, addition of calyculin A effectively suppressed the decline in protein phosphorylation state and increased an. inactive form of protein phosphatase I in the postacrosomal region. On the other hand, this inhibitor had no influence on the protein phosphorylation state in the acrosome and equatorial segment. After incubation without calyculin A for 180 or 360 min, many spermatozoa exhibited acrosomal changes and loss that indicated occurrence of the acrosome reaction. However, addition of calyculin A significantly blocked these events. These results are consistent with our suggestion that postacrosomal serine/threonine-phosphorylated proteins are involved in suppression of the acrosome reaction in boar spermatozoa in vitro.SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD, 2008年06月, JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 54(3) (3), 171 - 176, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2007年11月, J. Reprod. Dev., 53(5), pp.1079-1086, 英語Premature Capacitation of Frozen-Thawed Spermatozoa from Subfertile Japanese Black Cattle[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Evidence for existence of cAMP-Epac signaling in the heads of mouse epididymal spermatozoaCyclic adenosine 3',5'-monophosphate (cAMP) signaling regulates the expression of fertilizing ability in mammalian spermatozoa. Many articles indicate that this signaling is mediated mainly via protein kinase A. Recently, a guanine nucleotide exchange factor for small G protein Rap1 (an exchange protein directly activated by cAMP: Epac) was discovered as a new mediator of cAMP signaling in somatic cells. The aim of this study was to reveal the existence of cAMP-Epac signaling in mouse spermatozoa. Northern blot analysis and in situ hybridization suggested that Epac1 and Epac2 mRNAs were transcribed in the seminiferous epithelia of the testis. This shows that expression of Epac mRNAs is present in mouse testicular germ cells. Indirect immunofluorescence with specific polyclonal antibodies suggested possible co-localization of Epac1 and Rap1 proteins in the heads of epididymal spermatozoa. Moreover, treatment of epididymal spermatozoa with an Epac-specific cAMP analog, 8-pMeCPT-2'-O-Me-cAMP, induced activation of Rap1, as revealed with a commercial kit for pull-down assay. These results indicate the existence of cAMP-Epac signaling in the heads of mouse epididymal spermatozoa.SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD, 2007年02月, JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 53(1) (1), 127 - 133, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2006年09月, Mol. Reprod. Dev., 73(9), pp.1169-1178, 1169 - 1178, 英語A cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinase C activation is involved in the hyperactivation of boar spermatozoa.[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- We have shown that the assembly of lamin-associated polypeptide (LAP) 2 beta was detected surrounding the chromatin mass around the time of extrusion of the second polar body (PB) in some fertilized oocytes, but not in most activated oocytes, by using A23187 and cycloheximide (CaA + CH). Here, we immunohistologically analysed the correlation between LAP2 beta assembly and chromatin condensation in fertilized and activated oocytes during the second meiosis. In bovine cumulus cells, the onset of LAP2 beta assembly was observed around anaphase chromosomes with strongly phosphorylated histone H3. No LAP2 beta assembled around the chromosomes in the first and second polar bodies and the alternative oocyte chromatin (oCh) if histone H3 was phosphorylated. Only histone H3 of oCh was completely dephosphorylated during the telophase II/G1 transition (Tel II/G1), and then LAP2P assembled around only the oCh without phosphorylated histone H3. In the oocytes activated by CaA + CH, LAP2 beta did not assemble around the condensed oCh during the Tel II/G1 transition, although their histone H3 dephosphorylation occurred rather rapidly compared with that of the fertilized oocytes. The patterns of histone H3 dephosphorylation and LAP2 beta assembly in oocytes activated by CaA alone showed greater similarity to those in fertilized oocytes than to those in oocytes activated by CaA + CH. These results show that LAP2 beta assembles around only oCh after complete dephosphorylation of histone H3 after fertilization and activation using CaA alone, and that the timing of histone H3 dephosphorylation and LAP2 beta assembly in these oocytes is different from that of somatic cells. The results also indicate that CH treatment inhibits LAP2 beta assembly around oCh but not histone H3 dephosphorylation.CAMBRIDGE UNIV PRESS, 2006年05月, Zygote, 14(2) (2), 157 - 167, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The aim of this study was to reveal a downstream part of the intracellular signaling that is mediated by cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-dependent tyrosine kinases, including spleen tyrosine (Y) kinase (SYK), in boar spermatozoa. Ejaculated spermatozoa were incubated with cBiMPS (a cell-permeable cAMP analog; 0.1 mM) at 38.5 degrees C for 180 minutes and then used for Western blot and indirect immunofluorescence. Incubation of spermatozoa with cBiMPS induced tyrosine phosphorylation at the linker region of SYK (which was essential to binding to phospholipase C [PLC]gamma l) in the connecting and principal pieces, but the tyrosine phosphorylation was abolished by the addition of H-89 (a protein kinase A [PKA] inhibitor; 0.01-0.1 mM). Moreover, the cAMP-dependent tyrosine phosphorylation was also induced at the key regulatory residue of PLC gamma 1 in the same segments of spermatozoa, but it was inhibited by the addition of herbimycin A (a tyrosine kinase inhibitor; 5 mu M). These results suggest that the sperm cAMP-dependent tyrosine kinases, including SYK, are linked to the activation of PLC gamma 1. Indirect immunofluorescence clearly detected both inositol 1, 4,5-trisphosphate (IP3) receptor and calreticulin in the connecting piece, indicating the presence of internal calcium store. Cell imaging with fluo-3/AM (a cell-permeable Ca2+ indicator) showed that incubation of spermatozoa with cBiMPS increased intracellular free calcium in the middle piece, but that it was reduced by the addition of U-73122 (a PLC inhibitor; 0.02 mM). Based on our findings, we conclude that the connecting piece of boar spermatozoa possesses the PLC gamma 1-IP3 receptor-calcium signaling that is triggered by cAMP and mediated by PKA and herbimycin A-sensitive tyrosine kinases, including SYK.AMER SOC ANDROLOGY, INC, 2005年11月, JOURNAL OF ANDROLOGY, 26(6) (6), 732 - 740, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2005年01月, Theriogenology, 64(1) (1), 378 - 392, 英語Exogenous hyaluronic acid enhances porcine parthenogenetic embryo development in vitro possibly mediated by CD44[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- A cyclic adenosine 3',5'-monophosphate (cAMP)-dependent protein tyrosine phosphorylation is involved in the expression of fertilizing ability in mammalian spermatozoa. However, there are only limited data concerning the identification of protein tyrosine kinase (PTK) that is activated by the cAMP signaling. In this study, we have shown data supporting that boar sperm flagellum possesses a unique cAMP-protein kinase A (PKA) signaling cascade leading to phosphorylation of Syk PTK at the tyrosine residues of the activation loop. Ejaculated spermatozoa were washed and then incubated in a modified Krebs-Ringer HEPES medium (mKRH) containing polyvinyl alcohol (PVA) plus 0.1 mM cBiMPS (a cell-permeable cAMP analog), 0.25 mM sodium orthovanadate (Na3VO4) (a protein tyrosine phosphatase (PTP) inhibitor) or both at 38.5degreesC for 180 min. Aliquots of the sperm suspensions were recovered before and after incubation and then used to detect sperm tyrosine-phosphorylated proteins by Western blotting and indirect immunofluorescence. In the Western blotting, the anti-phosphotyrosine monoclonal antibody (4G10) recognized several bands including 72-kDa protein in the protein extracts from spermatozoa that were incubated solely with cBiMPS. The tyrosine phosphorylation in these sperm proteins was dependent on cBiMPS and enhanced by the addition of Na3VO4. The 72-kDa tyrosine-phosphorylated protein was apparently reacted with the anti-phospho-Syk antibody (Tyr525/526). Indirect immunofluorescence revealed that the connecting and principal pieces of spermatozoa incubated with cBiMPS and Na3VO4 were stained with the anti-phospho-Syk antibody. However, the reactivity of the 72-kDa protein with the antiphospho-Syk antibody was reduced by the addition of H-89 (a PKA inhibitor, 0.01-0.1 mM) to the sperm suspensions but not affected by the pretreatment of spermatozoa with BAPTA-AM (an intracellular Ca2+ chelator, 0.1 mM). Fractionation of phosphorylated proteins from the spermatozoa with a detergent Nonidet P-40 suggested that the 72-kDa tyrosine-phosphorylated protein might be a cytoskeletal component. Based on these findings, we have concluded that the cAMP-PKA signaling is linked to the Ca2+ -independent tyrosine phosphorylation of Syk in the connecting and principal pieces of boar spermatozoa. (C) 2004 Wiley-Liss, Inc.WILEY-LISS, 2004年12月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 69(4) (4), 436 - 447, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- A cAMP-induced increase of tyrosine-phosphorylated proteins is involved in the expression of fertilizing ability in mammalian spermatozoa. We (Harayama, 2003: J Androl 24:831-842) reported that incubation of boar spermatozoa with a cell-permeable cAMP analog (cBiMPS) increased a 32-kDa tyrosine-phosphorylated protein (TyrP32). The purpose of this study is to characterize the signaling cascades that regulate the cAMP-induced increase of TyrP32. We examined effects of tyrosine kinase inhibitor (lavendustin A), tyrosine phosphatase inhibitor (Na3VO4), cell-permeable calcium chelator (BAPTA-AM), and cholesterol acceptor (methyl-beta-cycloclextrin: MBC) on the increase of TyrP32 and the change and loss of acrosomes in boar spermatozoa. The spermatozoa were used for detection of tyrosine-phosphorylated proteins by Western blotting and indirect immunofluorescence and for examination of acrosomal integrity by Giemsa staining. At least eight tyrosine-phosphorylated proteins including TyrP32 exhibited the cAMP-dependent increase during incubation with cBiMPS. In many proteins of them, this increase was reduced by lavendustin A but was enhanced by Na3VO4. In contrast, the cAMP-induced increase of TyrP32 was abolished by Na3VO4 but was hardly affected by lavendustin A. Giemsa staining showed that the increase of spermatozoa with weakly Giemsa-stained acrosomes (severely damaged acrosomes) or without acrosomes was correlative to the cAMP-induced increase of TyrP32. Moreover, the lack of calcium chloride in the incubation medium or pretreatment of spermatozoa with BAPTA-AM blocked the change and loss of acrosomes and the increase of TyrP32, suggesting these events are dependent on the extracellular and intracellular calcium. On the other hand, incubation of spermatozoa with MBC in the absence of cBiMPS could mimic the change and loss of acrosomes and increase of TyrP32 without increase of other tyrosine-phosphorylated proteins. Based on these results, we conclude that the cAMP-induced increase of TyrP32 is regulated by a unique mechanism that may be linked to the calcium-dependent change and loss of acrosomes. (C) 2004 Wiley-Liss, Inc.WILEY, 2004年10月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 69(2) (2), 194 - 204, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The present study was designed to clarify the localization of LAP2beta and to compare it with those of lamins A/C and B in bovine oocytes after activation and in vitro fertilization (IVF). After fertilization, LAP2beta was not found until telophase II, and was observed around condensed chromatin after the extrusion of the second polar body, but not in activated oocytes. Although the reaction of LAP2beta was temporally negative or weak on the membrane of the growing small pronuclei, it became strong on the fully grown pronuclei of both activated and fertilized oocytes. Examination of the timing of DNA synthesis using bromodeoxyuridine revealed that the expression of LAP2beta on the pronuclear membrane became strong around the end of the DNA synthesis in both activated and fertilized oocytes. Both male and female pronuclei exhibited the same reactivity to all nuclear proteins examined. It was also shown that LAP2beta first assembled around condensed chromatin, followed by the integration of lamins B and A/C as in somatic cells. LAP2beta staining was maintained on the nuclear membrane of the embryonic cells at interphase until the later stage of preimplantational development. There were no differences between parthenogenetic and fertilized embryos in the expression and localization of LAP2beta from the PN-stage oocyte to the blastocyst. The assembly of LAP2beta was observed around the telophase chromatin of both blastocyst and cumulus cells. Thus, it was shown that the timing of the aggregation of LAP2beta at the second meiosis was different from that in the mitosis of blastocyst and somatic cells. LAP2beta was constantly expressed in the nuclear membrane in iii vitro fertilized and parthenogenetic embryos as was lamin B, and lamin A/C was expressed stage-dependently in both types of embryos. Lamin A/C was positive in some inner cell mass cells of parthenogenetic blastocysts, but not those of iii vitro fertilized embryos.CAMBRIDGE UNIV PRESS, 2004年02月, ZYGOTE, 12(1) (1), 81 - 93, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Viability and protein phosphorylation patterns of boar spermatozoa agglutinated by treatment with a cell-permeable cyclic adenosine 3 ',5 '-monophosphate analogBoar spermatozoa become agglutinated with one another at the head when their intracellular cyclic adenosine 3',5'-monophosphate (cAMP)-signaling cascades are activated in the head. The aim of the present study is to examine viability and protein phosphorylation patterns of cAMP-dependently agglutinated boar spermatozoa. Ejaculated spermatozoa were washed and then incubated in a modified Krebs-Ringer HEPES medium containing polyvinyl alcohol (mKRH-PVA) plus 0.1 mM Sp-5,6-clichloro-1-beta-D-ribofuranosyl-benzimidazole-3',5'-monophosphorothioate (cBiMPS, a cell-permeable cAMP analog) at 38.5degreesC up to 180 minutes. Aliquots of the sperm suspensions were recovered after various incubation periods and then used to examine the state of agglutination, the viability by SYBR14-PI staining and motility assay, and the state of protein phosphorylation by Western blotting and indirect immunofluorescence. In the control samples incubated without cBiMPS for 180 minutes, less than 30% of the total spermatozoa were agglutinated with one another at the heads, and more than 70% of the agglutinated spermatozoa were propidium iodide (PI)-positive (dead). However, the incubation with cBiMPS rapidly increased the percentages of head-to-head agglutinated spermatozoa to approximately 60% within 30 minutes, but did not significantly change them thereafter. In the samples incubated with cBiMPS for 180 minutes, moreover, the percentages of PI-positive cells of the agglutinated spermatozoa (approximately 30%) were significantly lower than those obtained in the control samples (more than 70%). This result was supported by the observation that the percentages of motile cells of the agglutinated spermatozoa were much higher in the samples incubated with cBiMPS for 180 minutes than in the control samples incubated without cBiMPS. As revealed by Western blotting and indirect immunofluorescence, cBiMPS-induced serine/threonine phosphorylation of the proteins (eg, >220 kd, 220 kd, 180 kd, 84 kd, and 54 kd) appeared mainly in the connecting and principal pieces of both agglutinated and free spermatozoa within 30 minutes, and additional phosphorylation occurred in the middle piece later than 30 minutes. Moreover, tyrosine phosphorylation of the proteins (eg, >220 kc, 190 kc, 93 kd, 59 kd, 54 kc, and 32 kd) was induced intensely in the connecting and principal pieces and moderately in the middle piece of almost one half of the agglutinated spermatozoa after incubation with cBiMPS for more than 30 minutes, but rarely in those of the free spermatozoa. These findings are consistent with the following suggestions: activation of the cAMP-signaling cascades leads to rapid (within 30 minutes) head-to-head agglutination in live spermatozoa; rapid (within 30 minutes) protein serine/threonine phosphorylation in the connecting and principal pieces of both cAMP-dependently agglutinated and free spermatozoa and subsequent (later than 30 minutes) phosphorylation in the middle piece of them; and slow (later than 30 minutes) protein tyrosine phosphorylation in the connecting, middle, and principal pieces of the cAMP-dependently agglutinated spermatozoa. Based on these suggestions, we conclude that many of cAMP-dependently agglutinated spermatozoa are live cells in which cAMP-signaling cascades leading to protein serine/threonine and tyrosine phosphorylation are activated in the whole flagellum.AMER SOC ANDROLOGY, INC, 2003年11月, JOURNAL OF ANDROLOGY, 24(6) (6), 831 - 842, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2003年09月, 日本胚移植学雑誌, 25,pp.101-107(3) (3), 101 - 107, 日本語黒毛和種精漿酸性タンパク質の濃度に及ぼす季節の影響[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Stage-specific effects of the osmolarity of a culture medium on the development of parthenogenetic diploids in the pigThe objective of this study was to investigate the effects of osmolarity of culture media on the development of porcine parthenogenetic diploids. Oocyte-cumulus-granulosa cell complexes were collected from ovaries and then in vitro-cultured for 48 h. The mature oocytes were subjected to a single electro-stimulation (El-St; 100 mus, 1500 V/cm), treated with 5.0 mug/ml Cytochalasin B for 4 h and then cultured under various conditions as described below. In Experiment 1, the diploids were cultured for 168 h after El-St in modified Whitten's medium with 256 mOsmol (mWM256), mKRB with 309 mOsmol, and mWM with 309 mOsmol (mWM309), in which the osmolarity was adjusted by addition of NaCl or mannitol, or by reduction of distilled water. In Experiment 2, the diploids were cultured in the five media used in Experiment I for the first 48 h, and then in mWM256 until 168 h after El-St. In Experiment 3, the diploids were cultured for the first 48 h in mWM with osmolarity adjusted from 256 to 330 mOsmol by addition of NaCl for the first 48 h and then in mWM256 until 168 It after EI-St. In Experiment 4, the diploids were cultured in mWM with 290 mOsmol (mWM290) for the first period of 24, 48, or 72 h, and then in mWM256 untDil 168 h after El-St. In Experiment 5, after diploids were cultured in mWM290 for the first 48 h, the obtained 4-cell diploids were transferred to mWM with osmolarity adjusted from 200 to 310 mOsmol by addition of NaCl, then cultured until 168 h after EI-St. All media were supplemented with 0.5 mg/ml hyaluronic acid and 4.0 mg/ml bovine serum albumin. The results obtained in Experiments 1-5 indicate that the osmolarity of a medium, but not the Na+/K+ ratio, exerts effects on the development of diploids to the blastocyst stage. The change of osmolarity of the culture media after the 4-cell stage increased the rate of expanded blastocyst formation in porcine diploids. The optimal osmolarities of culture medium for the first 48 h after El-St (before the 4-cell stage) were 290 and 280-320 mOsmol, and those for the later period (after the 4-cell stage) were 256 and 220-270 mOsmol, respectively. (C) 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE INC, 2003年02月, THERIOGENOLOGY, 59(3-4) (3-4), 719 - 734, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2003年02月, J. Androl., 24,pp.91-99, 91 - 99, 英語Involvement of cytoplasmic free calcium in boar sperm: head-to-head agglutination induced by a cell-permeable cyclic adenosine monophosphate analog[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Localization of Lap2B in oocytes and embryos during early development in cattleLAP2βはラミンの裏打ち蛋白であるがその機能については不明な点が多い。ウシ胚においてこのLAP2βの局在と発現について観察した。LAP2βの発現や局在は体外受精卵や単為発生胚で差がなく発生が進むにつれて前核期よりも発現が強くなることを示した。2003年01月, Theriogenology 第59巻 474 (abstr), 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Capacitation-like alterations in cooled boar spermatozoa: assessment by the chlortetracycline staining assay and immunodetection of tyrosine-phosphorylated sperm proteinsThis study was undertaken in order to characterize alterations occurring in cooled boar spermatozoa by a chlortetracycline (CTC) staining assay and immunodetection of tyrosine-phosphorylated sperm proteins. Spermatozoa were collected from 10 mature boars, washed and then resuspended in a Tris-citric acid-glucose (TCG) solution. The sperm suspensions were slowly cooled to 4 degreesC over 5 h and held for 2 days. Aliquots of the sperm suspensions were recovered before and after the cooling treatment and then used for the CTC staining assay and immunodetection of tyrosine-phosphorylated sperm proteins. Before the cooling treatment, almost all of the spermatozoa stained with CTC were characterized by uniform fluorescence over the whole head (an F pattern: uncapacitated spermatozoa). After the cooling treatment, however, significant higher percentages of spermatozoa exhibited a B pattern with a dark band of diminished fluorescence in the post acrosomal region and a relatively bright fluorescence in the acrosomal region (the pattern of capacitated spermatozoa). Coincidently, a 32 kDa tyrosine-phosphorylated protein appeared in the spermatozoa. However, these alterations occurring in the cooled spermatozoa were attenuated by the supplementation to the sperm suspensions with seminal plasma (20% (v/v)). Additionally, the same alterations were observed in the spermatozoa incubated in a capacitation-supporting medium (a modified Krebs-Ringer bicarbonate; mKRB) for 5 h. These results suggest that cooling could induce capacitation-like alterations in boar spermatozoa that were associated with the tyrosine phosphorylation of the 32 kDa sperm protein. (C) 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.ELSEVIER SCIENCE BV, 2002年10月, ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE, 73(3-4) (3-4), 197 - 209, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Relationship between bicarbonate and cyclic nucleotide in the promoting effects on head-to-head agglutination in boar spermatozoaAim: To clarify the relationship between bicarbonate and cAMP in the promoting effects on the sperm agglutination. Methods: Spermatozoa were collected from mature boars, washed and resuspended in a modified Krebs-Ringer HEPES lacking calcium chloride (mKRH). The sperm suspensions were incubated in a water bath (38.5 degreesC) for 60 min and then the percentage of head-to-head agglutinated spermatozoa was determined. Results: Supplementation of the mKRH with sodium bicarbonate (5-10 mM) significantly raised the percentage of head-to-head agglutinated spermatozoa in the samples. The addition of selective inhibitors for calcium/calmodulin-dependent phosphodiesterases (type 1: 8-methoxymethyl-IBMX and vinpocetine, 25-50 muM) or for cAMP-specific phosphodiesterases (type 4: Ro20-1724 and rolipram, 25-50 muM) enhanced the effect of bicarbonate on sperm agglutination as highly as did the addition of non-selective inhibitors for phosphodiesterases (IBMX and papaverine, 25-50 muM). A calmodulin antagonist (W-7, 2 muM), that potentially blocks the stimulator of the calcium/calmodulin-dependent phosphodiesterases, significantly enhanced the effect of bicarbonate on sperm agglutination. Moreover, a phosphodiesterase-resistant cAMP analogue (cBiMPS, 0.1 mM) markedly induced agglutination in more spermatozoa (76%) after the incubation without bicarbonate and phosphodiesterase inhibitors than did a less potent cAMP analogue (dibutyryl cAMP, 1 mM) (21%), while three kinds of cGMP analogues (0.1-1 mM) had no effect on sperm agglutination. In addition, a cAMP antagonist (Rp-cAMPS, 1 mM) significantly reduced the sperm agglutination resulting from the actions of bicarbonate and IBMX. On the other hand, the effect of bicarbonate was abolished by a change of incubation temperature from 38.5degreesC to 25degreesC. Conclusion: These findings demonstrate that the bicarbonate-induced agglutination of boar spermatozoa is controlled via the cAMP-mediated, temperature-dependent signaling cascade. This cascade is suppressed by the action of the phosphodiesterase (at least types 1 and 4).SCIENCE CHINA PRESS, 2002年06月, ASIAN JOURNAL OF ANDROLOGY, 4(2) (2), 87 - 96, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2002年06月, Biol Reprod., 67(6), pp. 1688-1698, 1688 - 1698, 英語Characteristics of preimplantational development of porcine parthenogenetic diploids relative to the existence of amino acids in vitro[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The development of porcine parthenogenetic diploid oocytes with homogeneous genomic components in vitroThe aim of this study was to determine the influence of the homogeneity of genomic components and ploidy on the in vitro development of porcine parthenogenetic oocytes to the blastocyst stage. In vitro matured oocytes were subjected to a single pulse of electro-stimulation (El-St; 100 musec, 1,500 V/cm) for activation. First, the activated oocytes were cultured for 6, 16, 18, 20 and 22 h after El-St, and examined for the timing of the first cleavage of parthenogenetic haploids. Next, the effects of the timing and duration of cytochalasin B (CB) treatment on inhibition of the first cleavage of haploids were examined in order to produce homogenous parthenogenetic diploids. Then the developmental ability to the blastocyst stage was compared among activated oocytes with genomic components of haploid (without CB treatment), homogeneous diploid (nn-diploid, CB treatment for 6 h from 20 h after El-St), and heterogeneous diploid (nn'-diploid, CB treatment for 4 h immediately after El-St). Most haploids were at the prophase to telophase of the first cleavage between 16 and 22 h after El-St. When the haploids were treated with 5.0 mug/ml CB for 6 h from 20 h after El-St, their first cleavage was efficiently suppressed, and most of them (84%) became diploids. The frequency of parthenogenetic development to the blastocyst stage was significantly lower in haploids (5%) than in nn-diploids (48%, P<0.01) or nn'-diploids (57%, P<0.01). These results shows that ploidy of activated oocytes, but not the homology of genomic components, affects the development of porcine parthenogenetic oocytes to the blastocyst stage.SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD, 2002年04月, JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 48(2) (2), 157 - 166, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2002年01月, 日本胚移植学雑誌, 24(1), pp.1-8(1) (1), 1 - 8, 日本語黒毛和種精漿における繁殖能力関連タンパク質Osteopontinの検出[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2001年, Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 14(8) (8), 1196 - 1202Factors Regulating Changes of Head-to-Head Agglutinability in Boar Spermatozoa during Epididymal Transit and Capacitation in Vitro - Review -[査読有り][招待有り]
- Biochemical characterization of sialoprotein "anti-agglutinin" purified from boar epididymal and seminal plasmaSialoprotein "anti-agglutinin," previously shown to inhibit sperm head-to-head agglutination, is found in both boar epididymal and seminal plasma. The present report characterizes anti-agglutinin by mass spectrometry, by N-terminal amino acid sequence analysis, and by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and Western blotting techniques to assess phosphate content of the molecule. Anti-agglutinin had the SDS-PAGE mobility of approximately 25 kDa. By electrospray ionization-mass spectrometry, however, mass spectra of anti-agglutinin were characterized by two major peaks (19,379-19,382 Da and 19,395-19,397 Da) and several minor peaks. Mass spectrometry of tryptic peptide fragments of deglycosylated anti-agglutinin and amino acid sequence analysis revealed that the protein has a unique peptide-mass fingerprinting of fragments (12,668 Da, 5,209 Da, 1,226 Da, and 1,168 Da) and a novel N-terminal amino acid sequence (KTDDY AISGA KEEEF YDYME ELYAV), respectively. Additionally Western blot techniques, using commercially available monoclonal antibodies, were used to detect presence of phosphothreonine and phosphoserine substituents, but two different monoclonal antibodies did not detect phosphotyrosine. Moreover, treatment with two different alkaline phosphotases converted the molecule, as assessed by SDS-PAGE and detection by silver stain, from the parent form of about 25 kDa to forms of approximately 19 kDa (similar to that assigned by mass spectrometry) and/or 15 kDa. Original antiserum generated toward, and reacting with native anti-agglutinin, reacted only with 19 kDa form. These results are consistent with the conclusion that the native anti-agglutinin may be a novel protein that is phosphorylated at serine and/or threonine residues. (C) 2000 Wiley-Liss, Inc.WILEY-LISS, 2000年01月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 55(1) (1), 96 - 103, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Role of cyclic adenosine 3 ',5 '-monophosphate and serum albumin in head-to-head agglutination of boar spermatozoaIt has previously been shown that when boar spermatozoa are incubated in a modified Krebs-Ringer bicarbonate (mKRB), head-to-head agglutination occurs in many cells. The aim of the present study was to investigate the effects of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate (cAMP) and serum albumin on sperm agglutination and to discuss a possible mechanism for sperm agglutination. Spermatozoa were collected from four mature boars, washed and incubated in mKRB. After a 1-h incubation, a sample of each sperm suspension was smeared gently on a separate glass slide, dried and stained in a phosphate-buffered solution of Giemsa to assess the percentage of head-to-head agglutinated cells in each suspension. In the samples incubated in mKRB, approximately 50% of the spermatozoa were agglutinated with one another at the acrosome. However, the percentages of head-to-head agglutinated spermatozoa were greatly reduced by a lack of calcium chloride in mKRB, but were recovered by the addition of dibutyryl cAMP (dbcAMP, a cAMP analogue) in a dose-dependent manner between 1 and 1000 muM. Addition of 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, 100 and 500 muM) instead of dbcAMP also significantly increased the percentages of head-to-head agglutinated spermatozoa. Moreover, the effects of adding dbcAMP were attenuated by treatment with Rp-adenosine 3',5'-cyclic monophosphorothioate triethylamine salt (0.25-1.0 mM, a cAMP antagonist) or H-89 (5 muM, a protein kinase-A inhibitor), but were enhanced by treatment with okadaic acid (500 nM) and calyculin A (500 nM) (inhibitors of protein serine/threonine phosphatase). In sperm samples incubated in mKRB containing 0.1% polyvinyl alcohol (mKRB-P) or mKRB-P lacking calcium chloride and supplemented with 1 mM dbcAMP, a lack of bovine serum albumin (BSA) resulted in a significant decrease in the percentages of head-to-head agglutinated spermatozoa. Addition of porcine serum albumin (PSA, 1-4 mg mL(-1)) or methyl-beta -cyclodextrin (MBC, 5-10 mg mL(-1)) instead of BSA was as effective as BSA (4 mg mL(-1)) in enhancing sperm agglutination. However, the effects of BSA (4 mg mL(-1)) or MBC (5 mg mL(-1)) were reduced by pre-mixing these reagents with cholesterol 3-sulfate (a cholesterol analogue, 5 mug mL(-1) for BSA and 375 mug mL(-1) for MBC). In addition, a protein 'anti-agglutinin' inhibiting sperm agglutination, was extracted from spermatozoa incubated with serum albumin or MBC and detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting techniques. The obtained Western blots revealed that sperm-bound anti-agglutinin was detected less in the samples incubated with either BSA (4 mg mL(-1)) or MBC (5-10 mg mL(-1)), compared with control samples. Moreover, pre-mixing MBC (5 mg mL(-1)) with cholesterol 3-sulfate (375 mug mL(-1)) reduced this reagent's effects on the loss of sperm-bound anti-agglutinin. Additionally, the assay of sperm agglutination and a chlortetracycline staining assay revealed that the percentages of head-to-head agglutinated spermatozoa were positively correlated with those of spermatozoa classified into B pattern (capacitated spermatozoa). These results are consistent with the following suggestions: (i) an adenylyl cyclase-cAMP-protein kinase system mediates a signalling pathway leading to head-to-head agglutination; and (ii) loss of anti-agglutinin from the spermatozoa may be modulated by changes in the plasma membrane induced by actions of serum albumin or MBC contained in a medium.C S I R O PUBLISHING, 2000年, REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT, 12(5-6) (5-6), 307 - 318, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Immunolocalization of anti-agglutinin for spermatozoa in boarsA boar "anti-agglutinin," which inhibits head-to-head agglutination of spermatozoa, has been identified as a 25-kDa sialoprotein contained in epididymal and seminal plasma. This study was conducted to determine the location of the anti-agglutinin on spermatozoa and in various organs, including epididymides, by indirect immunofluorescence and Western blotting techniques. Ejaculated boar spermatozoa were washed and subjected to immunocytochemical observation. Epididymal plasma was recovered from three different regions of epididymides and subjected to sodium dodecylsulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and Western blotting. Twelve kinds of organs (testis, epididymis, seminal vesicle, prostate, heart, liver, kidney, spleen, stomach, small intestine, lung, and muscle) were recovered from boars, The unilateral epididymides were fixed, cut into 10-mu m frozen sections, and subjected to immunohistochemical observation. The other organs were homogenized and used for SDS-PAGE and Western blotting. Immunocytochemical observations revealed that the antiserum strongly recognized the acrosomal region and equatorial segment on unfixed and methanol fixed spermatozoa. Immunohistochemical observations revealed that the epithelia of the epididymal ducts were recognized by the antiserum mainly in the corpus epididymides. Moreover, the antiserum reacted with the luminal contents of the corpus and cauda epididymides, However, no specific reaction was detected in the caput epididymides. Western blotting showed that the antiserum selectively recognized a band of the anti-agglutinin in the corpus and cauda epididymal plasma, although no band was detected in the caput epididymal plasma. In the extracts from various organs, the single band was detected in the corpus and cauda epididymides at the same mobility as the anti-agglutinin, but not in the other organs. Based on these results, the following matters concerning the anti-agglutinin are discussed: (1) the importance of its association with the acrosome of spermatozoa in inhibiting sperm head-to-head agglutination; (2) its origin in the epididymis; and (3) its tissue specificity. Mel. Reprod. Dev. 52:269-276, 1999. (C) 1999 Wiley-Liss, Inc.WILEY-LISS, 1999年03月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 52(3) (3), 269 - 276, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Changes in epididymal protein anti-agglutinin on ejaculated boar spermatozoa during capacitation in vitroThis study is a detailed investigation of changes in epididymal protein anti-agglutinin on ejaculated boar spermatozoa during an incubation designed to promote capacitation in vitro. Ejaculated spermatozoa were collected from six mature boars, washed, and incubated to promote capacitation. Sperm samples were subjected to Western blotting-densitometric analyses, flow cytometry after immunostaining and immunocytochemical observation by indirect immunofluorescence. An antiserum to anti-agglutinin was raised in a rabbit by subcutaneous injection of a purified antigen, as described previously (Harayama et al. 1999). Western blotting-densitometric analyses revealed an approximate halving of the amount of sperm-bound anti-agglutinin during the first 45-min incubation, followed by a gradual decrease thereafter. Comparison between immunostained sperm samples by flow cytometry before and after incubation confirmed this decrease in sperm-bound anti-agglutinin during the incubation. Microscopic characterization established that this decrease occurred mainly on the acrosome. Supplementation with seminal plasma (5% or 10%, v/v) attenuated the decrease. These findings are consistent with the conclusion that a large portion of the anti-agglutinin bound to sperm acrosomes is released at an early stage of the capacitation process in vitro.CSIRO PUBLISHING, 1999年, REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT, 11(4-5) (4-5), 193 - 199, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 1998年08月, 日本畜産学会報, 69(8) (8), 720 - 727, 日本語冷却処理後の梅山豚射出精子の運動性および先体の形態に及ぼす精漿成分の影響[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 1998年08月, Anim. Sci. Technol. (Jpn), 69(8), pp. 720-727(8) (8), 720 - 727, 英語Effects of seminal plasma components on motility and acrosomal integrity of Meishan boar spermatozoa after cooling treatments[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- ビタミンAの過剰摂取がニワトリの骨組織形成に及ぼす影響を究明するため,白色レグホン種で1週齢の雄ニワトリを用い,市販の幼雛飼料を給与しながら1日につき体重g当たり300または600単位のビタミンAを連日10日間経口投与した場合の脛骨について,軟X線吸収像の観察を行うとともに骨幹中央部の横断標本を組織学的および組織形態計測学的に検索した。その結果,ビタミンA過剰投与鶏の脛骨では,対照鶏に比べて,骨幹の幅が明らかに狭く,全般の骨質において軟X線吸収の低下が認められた。一方,骨幹の組織構造の観察では,骨膜が薄く,大部分の骨芽細胞は扁平で紡錘形をなしていた。そして,髄腔側の骨質でみられるオステオンは,中心管の広いものが多かった。このような組織形態の変化は,ビタミンAの投与量の増加によって,さらに顕著となった。破骨細胞の形態や細胞内空胞の大きさなどは,対照鶏の場合とよく類似していた。また組織形態計測学的には,緻密骨形成の遅延と骨芽細胞の減数萎縮が認められた。しかし,破骨細胞の大きさや数などの計測値については,対照鶏との間で差が認められず,骨吸収に対するビタミンA投与の影響は極めて少ないことが察知された。これらの結果からみると,ビタミンAの過剰摂取は,骨芽細胞の機能を低下させ,骨形成を抑制するものと考えられる。Japan Poultry Science Association, 1998年03月, Japanese Poultry Science, 35(2), pp. 108-116(2) (2), 108 - 116, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Glycosylated components of boar spermatozoa and epididymal plasma from the central caput, distal corpus and distal cauda epididymides were compared by electrophoretic and lectin blotting techniques. The four lectin reagents used in this study were Concanavalin A (Con A), Lens Culinaris Agglutinin (LCA), Ricinus Communis Agglutinin I (RCA I) and Peanut Agglutinin (PNA), which were labeled with peroxidase. The affinity of Con A and of LCA increased for three bands and one smear (A: > 86.8 kDa, B: 80 kDa, C: 65-75 kDa and D: 45 kDa) and for two bands and one smear (A, B and C) of extracts from spermatozoa, respectively, as they passed through the epididymis. RCA I apparently recognized one band and one smear (G: > 86.8 kDa and H: 46-58 kDa) of extracts from the distal cauda spermatozoa, though it hardly or faintly reacted with those from the central caput and distal corpus spermatozoa. PNA showed a similar affinity for band "G" to RCA I. Moreover, bands and smears with similar mobility (A, B, C, D, G and H) were also detected in epididymal plasma by lectin blotting techniques. On the other hand, several sperm components were detected more visibly with Con A (E: 37-41 kDa and F: 32-37 kDa), RCA I (I: 41 kDa) and PNA (I: 41 kDa and J: 47-51 kDa) in sperm extracts from the distal cauda than in those from the central caput, though no corresponding components were observed in epididymal plasma. These epididymal maturation-dependent modifications related to glycosylation in boar spermatozoa are discussed.The Japanese Society of Animal Reproduction (JSAR), 1998年, Journal of Reproduction and Development, 44(1) (1), 21 - 27, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Effects of calcium and bicarbonate on head-to-head agglutination in ejaculated boar spermatozoaThe present study was conducted to reveal the effects of calcium and bicarbonate on the occurrence of head-to-head agglutination in ejaculated boar spermatozoa in vitro. Boar spermatozoa were washed and incubated in a modified Krebs-Ringer bicarbonate (mKRB) in a 37 degrees C CO2 incubator (5% CO2 in air) for 1-5 h. Before and after the incubation, aliquots of each sperm sample were fixed, smeared on glass slides, and stained with a phosphate-buffered solution of Giemsa to assess the percentages of head-to-head agglutinated spermatozoa. Before the incubation, only 5-12% of the spermatozoa were agglutinated. After the 1-h incubation, however, the percentage of head-to-head agglutinated spermatozoa rose to approximately 50%, followed by only minor increases thereafter. This rise was dependent on the concentrations of calcium chloride contained in the mKRB and was attenuated by the addition of 2 mM [ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)]tetra-acetic acid (EGTA) to the medium. Moreover, the replacement of sodium bicarbonate with 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (Hepes) in the medium and treatment with ruthenium red, which have both been shown previously to inhibit calcium uptake by boar spermatozoa, significantly reduced the rise. Based on these findings, it was concluded that extracellular calcium and bicarbonate are key factors regulating head-to-head agglutination in boar spermatozoa. The possible relationship between agglutinability and the fertilizing ability of boar spermatozoa is also discussed.C S I R O PUBLISHING, 1998年, REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT, 10(5) (5), 445 - 450, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 1997年03月, Japanese Poultry Science, 34(2), pp. 124-131, 107 - 116, 英語Effects of dietary calcium levels on the histomorphology of proximal tibia in vitamin D-deficient chicks[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Electrophoretic characterization of boar epididymal antiagglutininBoar epididymal antiagglutinin, previously shown to inhibit sperm head-to-head agglutination, was purified from cauda epididymal plasma by precipitation with ammonium sulfate, anion-exchange chromatography, and reverse-phase HPLC, and was characterized by electrophoretic and membrane blotting techniques. Blotting techniques, using the ECL Glycoprotein Detection System (Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK) and wheat germ agglutinin (WCA)-peroxidase, established the presence of sialic acid residues on purified antiagglutinin. Removal of sialic acid residues from antiagglutinin greatly reduced its immunoreactivity with the specific antiserum. Further purification by two-dimensional PAGE established the presence of one major and two minor forms that cross-reacted with the antiserum, with only the major form reacting with WGA-peroxidase. Extracts of washed epididymal spermatozoa contained a polypeptide with the same electrophoretic mobility as the major form. Additionally, the antiserum detected cross-reacting material in seminal plasma and in extracts from ejaculated spermatozoa. When spermatozoa were incubated under conditions shown to promote capacitation, the cross-reacting material could not be detected in sperm extracts. These results are consistent with the following conclusions: 1) antiagglutinin contains sialic acid residues that may be related to its immunoreactivity and molecular heterogeneity, and 2) either sperm-bound antiagglutinin is released or its epitope recognized by the antiserum is altered after ejaculation and in vitro capacitation.SOC STUDY REPRODUCTION, 1996年08月, BIOLOGY OF REPRODUCTION, 55(2) (2), 325 - 332, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The timing of shedding and disintegration of cytoplasmic droplets from boar and goat spermatozoa was determined. More than 90% of spermatozoa from the cauda epididymidis and ductus deferens had a droplet each at the distal region of the middle piece in both species. In boars, the droplets were still observed in 97% of spermatozoa immediately after ejaculation. After 1 min of ejaculation, however, the percentage of spermatozoa without the droplet greatly increased to 65%, with no significant changes thereafter. Moreover, most of the free droplets shed from spermatozoa had already disappeared after 1 min of ejaculation. In goats, most spermatozoa (90%) had no droplet even immediately after ejaculation, and the rate of free droplets remaining in the semen was 63%. However, within 2 min of ejaculation, the rate of free droplets remaining in the semen dropped to 8%. These results indicate that shedding of cytoplasmic droplets from boar spermatozoa and their disintegration occur within 1 min after ejaculation. They also suggest that droplets are shed from most of goat spermatozoa during their transit through the urethra and/or immediately after ejaculation, and that their disintegration occurs within a few minutes after ejaculation.The Japanese Society of Animal Reproduction (JSAR), 1996年, Journal of Reproduction and Development, 42(4) (4), 237 - 241, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Fructose stimulates shedding of cytoplasmic droplets from epididymal boar spermatozoaThe aim of the present study was to establish the presence of an inducer(s) for the shedding of cytoplasmic droplets from boar spermatozoa after ejaculation. Cauda epididymal spermatozoa were incubated with seminal plasma, seminal vesicular fluid (SVF) or chemical agents at 39 degrees C for 30 min. After fixation and staining, percentages of spermatozoa without a droplet were determined. In the samples incubated with seminal plasma, SVF and a filtrate of SVF obtained after passage through an ultrafilter (molecular weight cut-off, 10 000), 43%, 60-69% and 43% of the spermatozoa were without a droplet respectively. The percentage of spermatozoa without a droplet after incubation with D-fructose (1.0 mM), which was one of the energy substrates included in SVF, was 76%. Furthermore, percentages increased to 93% and 90% with the addition of caffeine (2.0 mM) and N-6,2'-O-dibutyryl cyclic adenosine 3',5'-monophosphate (1.0 mM), respectively, but decreased to 48% with the addition of imidazole (2.0 mM). Based on these results, it is suggested that the shedding of cytoplasmic droplets from boar spermatozoa is induced by fructose originating from SVF. It also appears that this event is mediated by increasing the concentration of intracellular cyclic adenosine 3',5'-monophosphate.C S I R O PUBLICATIONS, 1996年, REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT, 8(7) (7), 1039 - 1043, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Distribution of the 25-kDa epididymal anti-agglutinin for spermatozoa was examined by the Western blotting technique in fluid collected from boar rete testes and epididymides. Fluid was collected from the rete testes and various regions of the epididymis, and then plasma and sperm extracts were prepared. Antiserum was raised against the anti-agglutinin, and specific antibody was purified from it. In the plasma, a reaction between the anti-agglutinin and purified antibody was first observed in the proximal corpus epididymidis and became stronger in the more distal regions. In extracts from washed spermatozoa using the original sample buffer, anti-agglutinin was detected between the proximal corpus and the distal cauda and more strongly in the distal corpus. A thorough washing of spermatozoa on a discontinuous Percoli gradient brought about only minor changes in the detection pattern of anti-agglutinin. However, in samples extracted from washed spermatozoa using a modified sample buffer containing twofold detergent and twofold 2-mercaptoethanol, a stronger reaction was observed between the anti-agglutinin and purified antibody in the distal cauda than in the distal corpus. These results indicate that free or loosely sperm-bound anti-agglutinin increases in the corpus and cauda epididymides. It is also suggested that solubility of the anti-agglutinin associated with spermatozoa in the original sample buffer decreases in the cauda epididymidis. © 1995, THE SOCIETY FOR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT. All rights reserved.1995年, Journal of Reproduction and Development, 41(2) (2), 113 - 121, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- IDENTIFICATION OF ANTI-AGGLUTININ FOR SPERMATOZOA IN EPIDIDYMAL BOAR PLASMAThe present report identifies epididymal boar anti-agglutinin and examines its effect on sperm motility. Boar spermatozoa from the cauda epididymidis were washed and incubated in modified Krebs-Ringer bicarbonate at 37-degrees-C (5% CO2 in air). In the samples washed three or five times and then incubated for 3-5 h, higher rates (72-79%) of spermatozoa were associated with one another at the acrosomal region, mainly in groups of 2-5 cells (head-to-head agglutination), and many cells exhibited intensively flagellant and/or circular types of movement but rarely progressive motility. The addition of epididymal plasma or 25 kDa protein purified from it markedly inhibited the occurrence of head-to-head agglutination in washed spermatozoa, whereas heat treatment and subsequent removal of insoluble materials reduced the anti-agglutination activity of epididymal plasma. The percentages of progressively motile cells in the samples incubated with epididymal plasma or 25 kDa epididymal protein rose coincident with the reduction of sperm agglutination. These findings demonstrate that the 25 kDa epididymal protein is an anti-agglutinin for the cauda spermatozoa and that it effectively functions to maintain progressive motility of the cells in vitro. (C) 1994 Wiley-Liss, Inc.WILEY-LISS, 1994年04月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 37(4) (4), 436 - 445, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- CAPACITY OF RETE TESTICULAR AND CAUDA EPIDIDYMAL BOAR SPERMATOZOA TO UNDERGO THE ACROSOME REACTION AND SUBSEQUENT FUSION WITH EGG PLASMA-MEMBRANEThe capacity to undergo the acrosome reaction and subsequent fusion with egg plasma membrane was examined in rete testicular and cauda epididymal spermatozoa from boars. Sperm penetration assay using zona-free hamster eggs demonstrated that the penetration rates for rete testicular spermatozoa preincubated for induction of the acrosome reaction for 2 and 3 h were 55% and 97%, respectively. However, most of the eggs (93%) were penetrated with polyspermy by cauda epididymal cells preincubated for 2 h. Results obtained by the triple-stain technique revealed the percentages of acrosome-reacted spermatozoa in the rete testicular and cauda epididymal samples preincubated for 3 h to be 61% and 74%, respectively. These results indicate that many rete testicular spermatozoa possess the capacity to undergo the acrosome reaction and subsequent fusion with egg plasma membrane in vitro, which appears to be completely established only after sperm transit through at least the proximal part of the epididymis.WILEY-LISS, 1993年05月, MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, 35(1) (1), 62 - 68, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 雄梅山豚における生殖機能の発達過程を明らかにする目的で,射精能力の発達および月齢に伴う精液性状の変化について検討した.包皮からの陰茎遊離は,検査した12頭のすべてにおいて64日齢までに確認された.手掌圧迫法により初めて精液が採取できたのは73～78日齢であった.採取された精液の液体部量,膠様物重量,1射精当りの総精子数および精子濃度はそれぞれ11ヵ月齢,10ヵ月齢,9ヵ月齢および5ヵ月齢まで有意に増加したが,前進精子率および奇形精子率については,3ヵ月齢で採取した精液で成豚の精液に匹敵する成績が得られた.他方,5日間および10日間の4°C保存後の試料における正常な頭帽を持つ生存精子の割合は,9ヵ月齢以上の雄から採取した精液を用いた場合に有意に高く,また,凍結保存後の試料での前進精子率および正常な頭帽を持つ生存精子の割合は8ヵ月齢以上の雄の精液において良好であった.以上のように,雄梅山豚は約2ヵ月齢で射精能力を獲得するが,繁殖用種雄として供用するのは6ヵ月齢以降にすべきと考えられる.また,精液を4°Cあるいは-196°Cで保存する場合には,9ヵ月齢以上の雄から採取した精液を用いることが望ましいと思われる.Japanese Society of Animal Science, 1993年04月, Anim. Reprod. Technol. (Jpn.), 64(4), pp. 333-339(4) (4), 333 - 339, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The objectives of the present study are to characterize the motility and penetrability into zona-free hamster eggs of boar spermatozoa from 7 regions of the epididymis. Spermatozoa from the caput epididymidis were immotile or exhibited a flagellant or circular type of movement. However, 80% of the cells from the proximal cauda showed an intensive, forward movement. When the spermatozoa from each region of the epididymis were coincubated with zona-free hamster eggs after preincubation for inducing the acrosome reaction, they exhibited high penetration rates (95-100%) and average number of spermatozoa (3.4-5.8) in penetrated eggs irrespective of their origin. These findings indicate that most of the spermatozoa acquire the ability to exhibit progressive motility during their transit through the corpus, and that at least some of the cells located in the proximal caput have the ability to fuse with egg plasma membrane. © 1993, THE SOCIETY FOR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT. All rights reserved.1993年, Journal of Reproduction and Development, 39(1) (1), 41 - 45, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- CAPACITY OF GOAT EPIDIDYMAL SPERMATOZOA TO UNDERGO THE ACROSOME REACTION AND SUBSEQUENT FUSION WITH THE EGG PLASMA-MEMBRANEThe capacity to undergo the acrosome reaction and subsequent fusion with the egg plasma membrane was examined in goat epididymal spermatozoa. Spermatozoa from the proximal and distal caput and distal cauda were preincubated in a sealed glass tube for induction of the acrosome reaction, and their viability, acrosome morphology and penetrability into zona-free hamster eggs were determined. A simplified triple-stain technique revealed that most of the preincubated live spermatozoa in the samples from the distal caput and distal cauda epididymides underwent morphological changes that indicated the occurrence of the acrosome reaction. Electron microscopic examination revealed that the outer acrosomal membrane of many spermatozoa in these samples showed fusion at multiple sites to the plasma membrane. However, the rates of acrosome-reacted cells in the proximal caput spermatozoa were still lower. The sperm penetration assay demonstrated that the penetration rates of distal caput and distal cauda spermatozoa preincubated for 2 h were 93% and 74% respectively, whereas proximal caput spermatozoa scarcely penetrated into eggs. These results indicate that increasing numbers of goat spermatozoa improve in the functions related to the acrosome reaction and subsequent fusion with the egg plasma membrane during their transit through the caput epididymidis.C S I R O PUBLICATIONS, 1993年, REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT, 5(3) (3), 239 - 246, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 生後の雄梅山豚における精のう腺,前立腺体部および尿道球腺の発達過程を形態学的および組織学的に観察した.すべての副生殖腺の重量は30～45日齢以後に顕著に増加した.1日齢の精のう腺および前立線体部では,腺上皮は未発達で,腺腔の拡大も不十分であった.しかし,45～60日齢になると,腺の終末部に部分的な分枝が見られ,腺腔にはPAS陽性の分泌物が認められた.75～90日齢では,腺の終末部は十公に発達した組織像を示した.他方,尿道球腺については,1日齢で腺の終末部に分枝が見られ,腺腔内にはPAS陽性の分泌物が観察された.30～45日齢になると,終末部は急速に拡大するとともに,分枝を増し,腺腔はPAS陽性物質で満たされていた.以上の結果から,雄梅山豚の精のう線,前立腺体部および尿道球腺は,それぞれ75～90日齢,75～90日齢および30～45日齢には十分に発達した分泌機能を備えると考えられる.Japanese Society of Animal Science, 1992年11月, Anim. Sci. Technol. (Jpn.), 63(11), pp. 1115-1122(11) (11), 1115 - 1122, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- INFLUENCE OF SEASON ON CHARACTERISTICS OF EPIDIDYMAL AND EJACULATED SEMEN IN MEISHAN BOARSMost of the epididymal spermatozoa collected in all the seasons examined maintained an ability to move progressively, had a cytoplasmic droplet in the distal site of the middle piece, and were morphologically normal. Reduced desire to mount a dummy was not observed during the experimental period. Characteristics of ejaculated semen were not significantly altered throughout the year. However, progressive motility and acrosomal integrity of spermatozoa ejaculated between July and September were more susceptible to storage at 4-degrees-C than spermatozoa ejaculated during the other months and acrosomal integrity of spermatozoa ejaculated during the 3 months was to freezing-thawing. These results indicate that the reproductivity activity of Meishan boars in Japan is only slightly influenced by season, but semen ejaculated during the summer is less suitable for storage than that ejaculated during the other seasons of the year.BUTTERWORTH-HEINEMANN, 1992年09月, THERIOGENOLOGY, 38(3) (3), 491 - 500, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 1992年08月, Proceedings of the International Symposium on Chinese Pig Breeds., pp. 162-165, 英語Seasonal changes of reproductive performance in Meishan boars[査読有り]研究論文（国際会議プロシーディングス）
- 1992年08月, Proceedings of the International Symposium on Chinese Pig Breeds, pp. 582-585, 英語In vitro storage of Meishan boar spermatozoa[査読有り]研究論文（国際会議プロシーディングス）
- 75～364日齢の雄梅山豚,合計22頭を用い,精巣上体通過に伴う精子の運動性および形態の変化について検討した.各雄から精巣上体を採取した後,8部位に区分し,各部位の精巣上体管内腔液を回収した.内腔液の一部は直ちにCa++欠KRB液で希釈し,精子の運動性を観察した.残りの内腔液にはグルタールアルデヒド含有PBSを等量加えて精子を固定した後,ギムザ染色標本を作製し,精子の形態を観察した.75日齢では,精巣上体尾精子のうちのわずか26%しか前進運動を示さなかった.また,59%が奇形精子で,その主なものは頭部奇形であった.さらに,62%の精子が細胞質滴を中片部の近位部に保持していた.しかし,105～120日齢になると,精巣上体の通過により89%の精子が活発な前進運動を示すようになり,98%の精子では細胞質滴が中片部の遠位部へと移動していた.他方,頭部奇形精子率については,90日齢以後において精子が精巣上体頭を通過する間に有意に低下した.以上の結果から,梅山豚の精巣上体は,精子を成熟させ,奇形精子を選択的に除去する機能を約120日齢までに獲得すると考えられる.Japanese Society of Animal Science, 1992年05月, Anim. Sci. Technol. (Jpn.), 63(5), pp. 462-467(5) (5), 462 - 467, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 雄金華豚における生殖器の生後の発達過程を形態学的および組織学的に観察した。精巣は45日齢以後に著しく発達し, 約75日齢には精細管腔に初めて精子が出現するとともに, 精上皮の組織構造が成熟型となった。精巣上体については, 45日齢以後に重量が急速に増加し, 60～75日齢までにはすべての部位で管上皮は十分に発達した組織構造を示した。他方, 副生殖腺の重量はいずれの腺も60日齢以後に急速に増加した。また, 精のう腺, 前立腺体部および尿道球腺はそれぞれ75～90日齢, 90日齢および30～45日齢までに終末部の著しい分枝を示し, 腺腔をPAS陽性の分泌物で満たしていた。以上の結果から, 雄金華豚は約75日齢で春機発動期に達することが知られる。また, 金華豚の生殖器は欧米改良種豚に比べて若齢で発達すると考えられる。The Japanese Society of Swine Science, 1992年02月, 日本養豚学会誌, 29(3), pp. 174-183(3) (3), 174 - 182, 日本語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 1992年02月, Asian-Aust. J. Anim. Sci., 5(1), pp. 165-171, 英語Development of the epididymis in Meishan boars[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- TESTICULAR DEVELOPMENT IN CHINESE MEISHAN BOARSThe developmental process of the testis and age-related changes in the morphology of rete testicular spermatozoa were investigated in Meishan boars at 1 to 364 days of age. Testicular weight and the diameter of seminiferous tubules increased rapidly until 150 to 180 days of age. Leptotene stage spermatocytes, round spermatids and spermatozoa were first found in the section of seminiferous tubules at 30 to 45, 60 and 75 days of age, respectively. However, after 105 to 120 days of age, most rete testicular spermatozoa were morphologically normal. These results indicate that Meishan boars reach puberty as early as 75 days of age, though the testes acquire the ability to produce morphologically normal spermatozoa at about 120 days.BUTTERWORTH-HEINEMANN, 1991年10月, THERIOGENOLOGY, 36(4) (4), 637 - 643, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 1991年09月, 家畜繁殖技術研究会誌, 13(3), pp. 158-164, 日本語4℃保存梅山豚精子の生存性および頭帽の形態に及ぼすイミダゾールの影響[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 70～71日齢の雌梅山豚(体重20～30kg)に性腺刺激ホルモンを投与し,卵子の成熟および排卵を誘起するとともに,卵胞卵子の体外培養による成熟誘起を行ない,得られた体外成熟卵胞卵子,体内成熟卵胞卵子および排卵卵子を用いて,それぞれの体外受精を試みた.Japanese Society of Animal Science, 1990年11月, Jpn. J. Zootech. Sci., 61(11), pp. 1011-1016(11) (11), 1011 - 1016, 英語
hCG投与39～40時間後には卵巣表面に突出した直径7mm以上の卵胞が平均18.0±11.3個認められ,さらにhCG投与42～43時間後には全個体の卵巣において平均6.5±3.7個の排卵卵胞が認められた.
ホルモン無処理の梅山豚より採取した卵胞卵子は,当初は緻密な卵丘細胞層に囲まれていたが,培養38時間後には卵丘が膨化し卵丘細胞は互いに遊離した状態となった.ホルモン投与した梅山豚の体内成熟卵胞卵子および排卵卵子の卵丘もほぼ同様な卵丘の膨化を呈していた.体外受精の結果,媒精12時間後の体外成熟卵胞卵子では72.3%が第II減数分裂中期以降に達しており,体内成熟卵胞卵子および排卵卵子ではそれぞれ72.3%および84.4%が第II減数分裂中期以降に達していた.精子侵入卵子率には各群間で有意な差は認められなかったが(66.7～77.8%),体内成熟卵胞卵子の雄性前核形成率は,体外成熟卵胞卵子および排卵卵子に比べて有意に高かった.精子侵入卵子当たりの侵入精子数は,梅山豚体外成熟卵胞卵子で多いのに比べ,排卵卵子では有意に少なく,体内成熟卵胞卵子ではその中間の値を示した.[査読有り]研究論文（学術雑誌） - 先体反応誘起後のヤギ精予の運動能,生存能および透明帯除去ハムスター卵子への侵入能保持時間を調べた.また,これらの特性に対するカフェインおよびイミダゾールの影響についても検討した.ヤギ射出精子を洗浄後,密封ガラス管内において39.5°Cで2時間加温して先体反応を誘起した.ついで,これらの精子をBO液,カブェイン添加BO液またはイミダゾール添加BO液に再浮遊して37°Cで5時間加温し,その間の運動性および生存性の変化を経時的に調べた.また,BO液またはイミダゾール添加BO液中に再浮遊直後の精子あるいは各媒液中で3時間加温した精子を透明帯除去ハムスター卵子とともに37°Cでさらに5時間培養し,その間の卵子への精子の侵入状況を経時的に調べた.得られた結果の概要は以下の通りである.1) ヤギ糖子では先体反応誘起の前と後で運動様式が異なり,誘起後の精子はムチ振り様の運動を行なった.2) 先体反応誘起後のヤギ精子の運動能および生存能は誘起前に比べて著しく低下した.3) ヤギ先体反応精子の透明帯除去ハムスター卵子への侵入能保持時間は3時間以内であった.4) 精子浮遊液へのイミダゾールの添加はヤギ先体反応精子の運動能および生存能の維持ならびに透明帯除去ハムスター卵子への侵入能保持時間の延長に有効であった.一方,カフェインの添加は運動性の一時的な付活には有効であったが,運動能および生存能の維持に対してはむしろ有害であった.Japanese Society of Animal Science, 1990年07月, Jpn. J. Zootech. Sci., 61(7), pp. 640-647(7) (7), 640 - 647, 英語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- トリパンブルー生体染色とギムザ染色を組み合わせた方法(TG染色法)によりヤギ先体反応精子の判別が可能か否かを検討した.TG染色の結果,ヤギ精子は正常先体を持つ生存精子と死滅精子,正常先体を持たない生存精子と死滅精子の4種類に分けられた.また,同時に行なわれた透明帯除去ハムスター卵子への精子侵入試験の結果から,ハムスター卵子に侵入可能な精子は正常先体を持たない生存精子であることが推定された.TG染色法とトリプルステイン(TS)簡便法を比較した結果,精子の類別結果に差異のないことが明らかにされ,TG染色法ではTS簡便法に比べ染色液の調製および染色手順が一層簡単であることも知られた.これらのことから,TG染色法はTS簡便法以上に有用なヤギ先体反応精子の判別法と考えられる.Japanese Society of Animal Science, 1988年03月, 日本畜産学会報, 59(3), pp. 235-240(3) (3), 235 - 240, 日本語[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 1988年01月, 家畜繁殖技術研究会誌, 10(1), pp. 10-14, 日本語梅山豚精子の体外保存[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 雄ヤギ5頭を用い, 精巣網カテーテル装着手術後の精巣および精巣上体頭の組織構造を観察するとともに精巣静脈血中のテストステロン濃度を調べた。カテーテル装着手術後の精巣は, いずれも萎縮し, 正常な精子形成過程が観察される精細管は少なかった。また, ライディヒ細胞の形態や染色性には異常は認められなかった。一方, 精巣上体頭では, 精巣上体管が萎縮し, 主細胞の高さは無傷のものよりも有意に減少した。同様の組織構造の変化は, 精巣輸出管を切除した場合の精巣および精巣上体頭でも認められた。精巣静脈血中のテストステロ神戸大学農学部, 1988年01月, 神戸大学農学部研究報告, 18(1), pp. 125-132(1) (1), 125 - 132, 日本語研究論文（学術雑誌）
- 4頭の成熟雄ヤギ(日本在来種)から精巣網カテーテル法によって採取した精巣網液および頚静脈血を用い, ラジオイムノアッセイによりテストステロン, エストラジオール-17βおよびプロジェステロン濃度を測定した。精巣網漿液中のホルモンの平均濃度は, テストステロンで67.8ng/ml, エストラジオール-17βで43.9pg/ml, プロジェステロンでは517.1pg/mlであった。どの個体においても昼間(0900-2100)と夜間(2100-0900)に採取した試料のテストステロン濃度に有意な差は認められなか神戸大学農学部, 1988年01月, Sci. Rept. Fac. Agr. Kobe Univ., 18, pp. 133-136(1) (1), 133 - 136, 英語研究論文（学術雑誌）
- 2019年10月, 日本アンドロロジー学会ニュースレター, 19, 3 - 4, 日本語家畜精子での受精制御分子について[招待有り]その他
- 日本胚移植研究会, 2017年09月, 日本胚移植学雑誌, 39(3) (3), 141, 日本語特集 哺乳類の精子研究における新展開 －基礎と応用― 序[招待有り]その他
- 2008年04月, 環境科学総合研究所年報, 26, pp. 45-52, 日本語人間との共生環境の回復を目的とした有害野生動物の繁殖抑制その他
- 2007年12月, 財）三島海雲記念財団平成18年度受贈者研究報告書, 44, pp. 19-23, 日本語精子鞭毛のハイパーアクチベーションを指標とする黒毛和種雄ウシの繁殖能力評価法の開発その他
- 2006年12月, 食肉に関する助成研究調査成果報告書, 24, pp. 52-56, 日本語黒毛和種雄ウシの生殖能力簡易評価法の確立：精子CTC染色法の追加適用その他
- 2005年12月, 食肉に関する助成研究調査成果報告書, 23, pp. 39-44, 日本語精子リン酸化タンパク質の定量解析による黒毛和種雄ウシの生殖能力簡易評価法[査読有り]その他
- 2000年12月, 食肉に関する助成研究調査成果報告書, 18, pp. 38-42, 日本語キャパシテーション過程にあるブタ精子での頭部間凝集を制御する細胞内情報伝達機構その他
- 2000年, J. Reprod. Dev., 46(Suppl.), pp. j43-j50, 日本語哺乳類精子の成熟変化を制御する分子[査読有り]記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）
- 1999年12月, 食肉に関する助成研究調査成果報告書, 17, pp. 29-33, 日本語キャパシテーション過程におけるブタ精子結合Anti-Agglutininの変化その他
- 1998年12月, 食肉に関する助成研究調査成果報告書, 16, pp. 79-83, 日本語ブタ精子の低温耐性を向上させる精漿タンパク質の精製および精子凍結保存への利用その他
- 共著, 第8章 雄の配偶子形成 pp. 67～78, 朝倉書店, 2025年02月, ISBN: 9784254450354動物生殖科学
- 共著, 第5章3 受精 pp. 228～237, 株式会社インターズ―, 2020年03月繁殖生物学 改訂版（第2版）
- 共著, 第5章 受精ー個体発生のはじまりー 5.3 哺乳類の受精 pp. 44～47, 株式会社培風館, 2019年04月, 日本語発生生物学 「哺乳類の受精」学術書
- 共著, Hokuto Shobo, 2003年, 英語Capacitation-related events in boar spermatozoa, Animal Frontier Sciences(pp. 37-43)学術書
- 共著, Hokuto Shobo, 2001年, 英語Regulation of head-to-head agglutination in boar spermatozoa by capacitation-related factors. Reproductive Biotechnology: Reproductive biotechnology update and its related physiology (pp. 203-209)学術書
- 共著, Hokuto Shobo, 2001年, 英語Early development of porcine parthenogenetic diploids in-vitro (Reproductive Biotechnology: Reproductive biotechnology update and its related physiology. pp.285-295)学術書
- 共著, Nakanishi Pub. Co., 1998年12月, 英語Purification and characterization of boar epididymal plasma protein Anti-Agglutinin. (Reproductive Biology Update: Novel tools for assessment of environmental toxicity. pp. 207-217)学術書
- 共著, Nakanishi Pub. Co., 1998年, 英語Electro-activation of in vitro-matured porcine oocytes and their development in vitro and in vivo (Reproductive Biology Update: Novel tools for assessment of environmental toxicity, pp. 117-127)学術書
- 第117 回日本繁殖生物学会大会, 2024年09月, 日本語ウシ凍結保存精子でのCalyculin-A誘発性Full-type Hyperactivationの発生制御へのカルパインの関与ポスター発表
- 第117 回日本繁殖生物学会大会, 2024年09月, 日本語ブタ精子でのFull-type Hyperactivationの誘起に及ぼす非受容体型タンパク質チロシンキナーゼの阻害剤の影響ポスター発表
- 第117 回日本繁殖生物学会大会, 2024年09月, 日本語ウシ精子でのCalyculin-A誘発性Full-type Hyperactivationの発生制御に機能するTRPCアイソフォームの探索ポスター発表
- 第73 回関西畜産学会大会, 2023年11月, 日本語ウシ凍結保存精子でのCalyculin-A 誘発性Full-type ハイパーアクチベーションの発生に及ぼすストア作動性チャネル非選択的阻害剤の影響口頭発表（一般）
- 第116回日本繁殖生物学会大会, 2023年09月, 日本語ウシ凍結保存精子でのCalyculin-A誘発性Full-type Hyperactivationの発生におけるストア作動性チャネルの関与口頭発表（一般）
- 第116回日本繁殖生物学会大会・市民公開講座「黒毛和牛をもっと増やそう！最新の繁殖生物学研究がお父さん牛にできること」, 2023年09月, 日本語お父さん牛の精子がお母さんの卵子とどのように受精するのか？[招待有り]公開講演，セミナー，チュートリアル，講習，講義等
- 日本アンドロロジー学会第42回学術大会 特別講演4, 2023年06月, 日本語人工授精での受胎率の向上を目指して －ウシ（黒毛和種）精子の新規検査法の開発－[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 日本アンドロロジー学会第42回学術大会, 2023年06月, 日本語ブタ射出精子での体外受精能力発現に及ぼす cAMP シグナリング活性化処理の影響ポスター発表
- 第115回日本繁殖生物学会大会, 2022年09月, 英語Relationship of the SERCA activity with the time courses of occurrence of full-type hyperactivation in bovine spermポスター発表
- 第115回日本繁殖生物学会大会, 2022年09月, 日本語cAMPアナログ・Ca2+処理されたブタ精子によるPDE阻害剤不含培養液中での卵子への侵入ポスター発表
- 日本アンドロロジー学会第41回学術大会, 2022年06月, 英語Involvement of cytoplasmic Ca2+ and SERCAs in the occurrence of helical movement in bovine spermポスター発表
- 日本アンドロロジー学会第41回学術大会, 2022年06月, 日本語ウシ凍結精子でのFull-typeハイパーアクチベーションの誘起のための処理条件の検討ポスター発表
- 第10回関西生殖医学集談会, 2022年03月, 日本語ウシ精子において化学物質処理により誘起されるHyperactivationの特性解析口頭発表（一般）
- 第71回関西畜産学会, 2021年10月, 英語A regulatory factor for the occurrence of helical movement in bovine cryopreserved sperm口頭発表（一般）
- 第114 回日本繁殖生物学会大会, 2021年09月, 英語Involvement of thapsigargin-sensitive Ca2+-ATPase in the occurrence of helical movement with 3-D rotation in cryopreserved bovine spermポスター発表
- 第114 回日本繁殖生物学会大会, 2021年09月, 日本語Thimerosal処理によりウシ精子で誘起される細胞内ストアのCa2+依存的なハイパーアクチベーションの運動様式ポスター発表
- 第114 回日本繁殖生物学会大会, 2021年09月, 日本語ウシ凍結精子でのFull-typeハイパーアクチベーションに及ぼすプロテインホスファターゼ阻害剤Calyculin Aの影響ポスター発表
- 日本アンドロロジー学会第40回学術大会, 2021年06月, 日本語ブタ液状保存精子でのFull-typeハイパーアクチベーションの誘起に及ぼすポリビニルアルコールおよびウシ血清アルブミンの影響口頭発表（一般）
- 日本アンドロロジー学会第39回学術大会, 2021年01月, 日本語ウシ射出精子の鞭毛運動に及ぼすNa+/K+-ATPase阻害剤Digoxinの影響ポスター発表
- 令和2年度 東海畜産学会 シンポジウム, 2020年12月, 日本語ウシ精子における精密性状検査法の開発[招待有り]口頭発表（基調）
- 第113回日本繁殖生物学会大会, 2020年09月, 日本語ブタ精子でのFull-type Hyperactivationの発生制御におけるカルモジュリンの役割ポスター発表
- 第46回山梨大学発生工学研究センターセミナー, 2019年12月, 日本語, 国内会議家畜精子の受精制御分子の探索と利用[招待有り]公開講演，セミナー，チュートリアル，講習，講義等
- 第112回日本繁殖生物学会, 2019年09月, 英語, 国内会議Involvement of digoxin-sensitive Na+/K+-ATPase in the regulation of bovine sperm motilityポスター発表
- 第112回日本繁殖生物学会, 2019年09月, 日本語, 国内会議黒毛和種精子におけるSPACA1タンパク質の特性解析ポスター発表
- 日本アンドロロジー学会第38回学術大会, 2019年06月, 日本語, 大阪国際会議場（グランキューブ大阪）, 国内会議低繁殖症の雄ウシを検出するための精子分子性状検査法のマーカー「SPACA1タンパク質」の解析ポスター発表
- 第111回日本繁殖生物学会大会, 2018年09月, 日本語, 上田市 信州大学繊維学部, 国内会議活力検査法の改良を目的としたウシ射出精子の運動様式の観察ポスター発表
- 日本アンドロロジー学会第37回学術大会, 2018年06月, 日本語, ラ・スイート神戸オーシャンガーデン, 国内会議cAMP-PKAシグナル伝達活性の違いがウシ精子の運動様式に及ぼす影響 － 精子の活力検査における評価基準の見直し －ポスター発表
- 第6回関西生殖医学集談会, 2018年02月, 日本語, 大阪市 ハービスPLAZA, 国内会議ウシ精子での細胞外Ca2+依存的なFull-typeハイパーアクチベーションの抑制に機能するカリクリンA感受性プロテインホスファターゼアイソフォームの特定口頭発表（一般）
- Fourth World Congress of Reproductive Biology (WCRB2017), 2017年09月, 英語, 沖縄県宜野湾市 沖縄コンベンションセンター, 国際会議Mechanism for the extracellular Ca2+-dependent occurrence of full-type hyperactivation in boar sperm treated with a cAMP analogポスター発表
- Fourth World Congress of Reproductive Biology (WCRB2017), 2017年09月, 英語, 沖縄県宜野湾市 沖縄コンベンションセンター, 国際会議Calyculin A-sensitive protein phosphatases which are involved in the suppression for full-type hyperactivation of bovine spermポスター発表
- 第5回関西生殖医学集談会, 2017年03月, 日本語, 大阪市, 国内会議ブタ精子での超活性化運動（Full-type HA）の開始におけるTRPC3チャネルの役割口頭発表（一般）
- UGSVS lecture, 2017年02月, 英語, 岐阜大学, 国内会議Advanced techniques for the reproduction in the cattle[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 第109回日本繁殖生物学会, 2016年09月, 日本語, 一社 日本繁殖生物学会, 相模原市（麻布大学）, 国内会議ブタ精子におけるfull-type hyperactivationの開始制御へのTRPC3チャネルの関与ポスター発表
- 第109回日本繁殖生物学会, 2016年09月, 日本語, 一社 日本繁殖生物学会, 相模原市（麻布大学）, 国内会議ウシ精子のハイパーアクチベーションを抑制するカリクリンA感受性プロテインホスファターゼの特定ポスター発表
- 日本アンドロロジー学会35回学術大会 シンポジウム1：男性不妊症の分子メカニズム, 2016年06月, 日本語, 前橋市・前橋テルサ, 国内会議先体タンパク質をマーカーとする哺乳類精子の分子性状検査法[招待有り]シンポジウム・ワークショップパネル（指名）
- 日本畜産学会第121回大会, 2016年03月, 日本語, 日本獣医生命大学, 国内会議ブタ精子での先体反応誘起に伴う頭部タンパク質SPACA1の変化ポスター発表
- 第4回関西生殖医学集談会・第48回関西アンドロロジーカンファレンス合同研究会, 2016年03月, 日本語, 大阪市, 国内会議ウシ新鮮射出精子における先体チロシンリン酸化タンパク質の分布状態口頭発表（一般）
- 第108回日本繁殖生物学会大会, 2015年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 宮崎, 国内会議ウシ新鮮射出精子の分子性状における個体差 －先体チロシンリン酸化タンパク質と人工授精成績との関係－ポスター発表
- 第35回関西生殖発生毒性フォーラム 基礎教育講演, 2015年04月, 日本語, 大阪市, 国内会議哺乳類の精子学 ー運動の開始から受精までー[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 第60回日本生殖医学会学術講演会 シンポジウム3 「受精に関する最近の話題」, 2015年04月, 日本語, 横浜, 国内会議人工授精成績・体外受精成績に影響を与える哺乳類精子の先体タンパク質[招待有り]シンポジウム・ワークショップパネル（指名）
- 日本畜産学会第119回大会, 2015年03月, 日本語, 宇都宮, 国内会議ウシ凍結精子での先体損傷・離脱に伴うIZUMO1の変化口頭発表（一般）
- 受胎率向上SIG第1回会合, 2014年12月, 日本語, 東京, 国内会議低繁殖症雄ウシの精子における欠陥型タンパク質の検出および特性解析[招待有り]シンポジウム・ワークショップパネル（指名）
- World Congress of Reproductive Biology 2014, 2014年09月, 英語, Edinburgh, UK, 国際会議The association between spatial distribution patterns of SPACA1 in human ejaculated sperms and outcomes of conventional IVFポスター発表
- 第107回日本繁殖生物学会大会, 2014年08月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 帯広, 国内会議黒毛和種精子でのチロシンリン酸化タンパク質の分布状態が先体の安定性に及ぼす影響ポスター発表
- 第107回日本繁殖生物学会大会, 2014年08月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 帯広, 国内会議ブタ胚盤胞におけるタイトジャンクション関連タンパク質claudin familyの発現性口頭発表（一般）
- 第107回日本繁殖生物学会大会, 2014年08月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 帯広, 国内会議ブタ精子での先体反応に伴う頭部タンパク質「SPACA1」の分布および分子マスの変化ポスター発表
- 第107回日本繁殖生物学会大会, 2014年08月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 帯広, 国内会議ウシ凍結保存精子における先体の損傷・離脱が頭部でのIZUMO1の分布に及ぼす影響ポスター発表
- 第107回日本繁殖生物学会大会, 2014年08月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 帯広, 国内会議ウシ精巣におけるcAMP依存性転写調節因子CREMの発現パターンの解析ポスター発表
- 日本アンドロロジー学会第33回学術大会 シンポジウム 1 「Capacitation の最前線を極める」, 2014年06月, 日本語, 軽井沢プリンスホテルウエスト, 国内会議家畜精子のハイパーアクチベーションに先立つ部位特異的なキャパシテーション[招待有り]シンポジウム・ワークショップパネル（指名）
- 第2回関西生殖医学集談会, 2014年03月, 日本語, 兵庫医科大学産婦人科学講座, 大阪市, 国内会議ブタ精子の鞭毛に分布するカルパイン2の役割口頭発表（一般）
- 第2回関西生殖医学集談会, 2014年03月, 日本語, 兵庫医科大学産婦人科学講座, 大阪市, 国内会議ヒト射出精子の頭部におけるSPACA1の分布状態の個体差 －先体主部での分布状態と体外受精成績との関係－口頭発表（一般）
- 日本畜産学会第118回大会, 2014年03月, 日本語, 日本畜産学会, つくば, 国内会議Full-type hyperactivationの誘起に伴う家畜精子の頸部および中片部における変化口頭発表（一般）
- 第106回日本繁殖生物学会大会, 2013年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 府中市, 国内会議人工授精で雌を受胎させにくい精子を産生する黒毛和種雄個体の検出法 －凍結保存後の精子先体の正常性と体内受精由来の移植可能胚率の関係－口頭発表（一般）
- 第106回日本繁殖生物学会大会, 2013年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 府中市, 国内会議ブタ精子におけるカルパインの検出および機能解析ポスター発表
- 第106回日本繁殖生物学会大会, 2013年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 府中市, 国内会議ヒト射出精子におけるSPACA1の検出 －先体での検出パターンと体外受精成績との相関性－ポスター発表
- 関西畜産学会第63回大会, 2013年09月, 日本語, 関西畜産学会, 彦根市, 国内会議ウシ精子の鞭毛におけるタンパク質チロシンリン酸化および超活性化運動の誘起口頭発表（一般）
- 日本畜産学会第116回大会, 2013年03月, 日本語, 日本畜産学会, 広島市, 国内会議ブタ精子での後帽部タンパク質の脱リン酸化および先体反応におけるcAMP-EPACシグナリングの役割口頭発表（一般）
- 日本畜産学会第116回大会, 2013年03月, 日本語, 日本畜産学会, 広島市, 国内会議ウシのハイパーアクチベーション精子における鞭毛タンパク質のリン酸化状態口頭発表（一般）
- 第105回日本繁殖生物学会大会, 2012年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, つくば市, 国内会議哺乳類精子の細胞内cAMPシグナル伝達機構に関する研究[招待有り]口頭発表（招待・特別）
- 第105回日本繁殖生物学会大会, 2012年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, つくば市, 国内会議黒毛和種精子先体前部におけるチロシンリン酸化型SPACA1の解析－サンプル間差および精子成熟に伴う変化について－ポスター発表
- 第62回関西畜産学会大会, 2012年09月, 日本語, 関西畜産学会, 和歌山市, 国内会議黒毛和種精子における先体の耐凍性マーカーの特性解析口頭発表（一般）
- 第105回日本繁殖生物学会大会, 2012年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, つくば市, 国内会議cAMP合成酵素ADCY10の異常型スプライスバリアントの検出によるウシ精子の新規の性状検査法口頭発表（一般）
- 日本アンドロロジー学会第31回学術大会, 2012年06月, 日本語, 日本アンドロロジー学会, 神戸市, 国内会議ブタの精巣および射出精子における活性型CREM（cAMP-responsive element modulator）の分子性状の解析口頭発表（一般）
- 日本畜産学会第115回大会, 2012年03月, 日本語, 日本畜産学会, 名古屋市, 国内会議黒毛和種精子における耐凍能マーカーの検出パターン口頭発表（一般）
- 日本畜産学会第115回大会, 2012年03月, 日本語, 日本畜産学会, 名古屋市, 国内会議ブタ雄性生殖細胞での活性型CREMの検出および分布解析口頭発表（一般）
- 第137回日本生殖医学会関西支部集談会, 2012年03月, 日本語, 大阪市, 国内会議ウシ精子における断片型ADCY10の合成メカニズム口頭発表（一般）
- 第104回日本繁殖生物学会大会, 2011年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 盛岡市, 国内会議ウシの可溶化型アデニル酸シクラーゼ (ADCY10) の断片型は精巣においてmRNAスプライスバリアントから合成されるポスター発表
- 第136回日本生殖医学会関西支部集談会, 2011年03月, 日本語, 大阪市, 国内会議ブタ精子でのcAMP依存的な鞭毛超活性化運動に及ぼすカルモジュリンアンタゴニストおよびカルパイン阻害剤口頭発表（一般）
- 日本動物学会第80回大会「第8回受精シンポジウム」, 2010年09月, 日本語, 日本動物学会, 静岡市, 国内会議哺乳類精子における部位特異的なcAMPシグナリング[招待有り]シンポジウム・ワークショップパネル（指名）
- 日本アンドロロジー学会第29回学術大会, 2010年07月, 日本語, 日本アンドロロジー学会, 東京, 国内会議ブタ精子中片部のAMPKはcAMP依存性ハイパーアクチベーションの発現制御に関与する口頭発表（一般）
- 11th International Symposium on Spermatology, 2010年06月, 英語, 宜野湾市, 国際会議Paternal exposure to 2,3,7,8-tetrachloro- dibenzo-p-dioxin (TCDD) affects the sex ratio of offspring at birth by change the sex ratio of fertilized eggポスター発表
- 11th International Symposium on Spermatology, 2010年06月, 英語, Naha, 国際会議Paternal exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) affects the sex ratio of offspring at birth by change the sex ratio of fertilized eggポスター発表
- 11th International Symposium on Spermatology, 2010年06月, 英語, Naha, 国際会議Immunodetection patterns of tyrosine-phosphorylated proteins in the head of frozen-thawed spermatozoa of Japanese Black bullsシンポジウム・ワークショップパネル（公募）
- 11th International Symposium on Spermatology, 2010年06月, 英語, Naha, 国際会議Identification of cAMP responsive element modulator (CREM) isoforms of the porcine testisポスター発表
- 日本畜産学会第112回大会, 2010年03月, 日本語, 日本畜産学会, 東京, 国内会議ブタ精巣におけるcAMP依存性転写調節因子CREMτの発現口頭発表（一般）
- 第135回日本生殖医学会関西支部集談会, 2010年03月, 日本語, 大阪市, 国内会議ブタの精子形成関連タンパク質の発現を制御するcAMPシグナリング構成分子の同定口頭発表（一般）
- 第135回日本生殖医学会関西支部集談会, 2010年03月, 日本語, 大阪市, 国内会議ウシ精巣におけるアデニル酸シクラーゼ10(ADCY10)mRNAsのスプライスバリアントの検出口頭発表（一般）
- International Symposium of Declining Fertility in Dairy Cows in the World; its Causes and Possible Solutions, 2010年02月, 英語, Miyazaki, 国際会議Subfertility in Japanese Black bulls and new methods to detect abnormal functionality of spermatozoaポスター発表
- 2009 Japan-Taiwan Joint Symposium on Cell Signaling and Gene Regulation, 2009年11月, 英語, Kobe, 国際会議Active protein kinase A (PKA) is required for the meiotic resumption of pig oocytesポスター発表
- 第102回日本繁殖生物学会大会, 2009年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 奈良市, 国内会議ブタ単為発生2倍体の胚盤胞への発生に及ぼすヘキソースの影響ポスター発表
- 第102回日本繁殖生物学会大会, 2009年09月, 英語, 日本繁殖生物学会, 奈良市, 国内会議Changes in protein kinase A (PKA) activity during meiotic resumption of pig oocytesポスター発表
- 日本アンドロロジー学会第28回学術大会, 2009年07月, 日本語, 日本アンドロロジー学会, 富山市, 国内会議ブタ精巣におけるcAMP依存性転写調節因子(CREM)ファミリーアイソフォームの発現口頭発表（一般）
- 日本アンドロロジー学会第28回学術大会, 2009年07月, 日本語, 日本アンドロロジー学会, 富山市, 国内会議ブタ精子におけるADCY10の検出口頭発表（一般）
- 34th Annual Meeting of the American Society of Andrology, 2009年04月, 英語, The American Society of Andrology, Philadelphia, 国際会議Detection of soluble adenylyl cyclase (ADCY10) homolog proteins in boar spermatozoaポスター発表
- 日本畜産学会第110回大会, 2009年03月, 日本語, 日本畜産学会, 藤沢市, 国内会議ブタ精子でのハイパーアクチベーションの発現制御における解糖系の役割口頭発表（一般）
- 第134回日本生殖医学関西支部集談会, 2009年03月, 日本語, 大阪市, 国内会議cAMPアナログ処理により鞭毛超活性化運動が誘起されたブタ精子でのAMPKサブユニットの分子変化口頭発表（一般）
- 第40回精子研究会シンポシウム, 2009年01月, 日本語, 精子研究会, 吹田市, 国内会議哺乳類精子の頚部特異的なcAMPシグナリングによるハイパーアクチベーションの制御[招待有り]シンポジウム・ワークショップパネル（指名）
- 第101回日本繁殖生物学会大会, 2008年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 福岡市, 国内会議低受胎率を示した黒毛和種あるいは正常な個体における凍結－融解精子鞭毛の超活性化運動口頭発表（一般）
- 日本アンドロロジー学会第27回学術大会, 2008年07月, 日本語, 日本アンドロロジー学会, 京都市, 国内会議cAMP-Epacシグナリングを介したブタ精子キャパシテーションの新規制御メカニズム口頭発表（一般）
- 33rd Annual Meeting of American Society of Andrology, 2008年04月, 英語, American Society of Andrology, Albuquerque, 国際会議Cyclic AMP-induced inactivation of PDK1 is linked to the enhancement of protein tyrosine phosphorylation and flagellar hyperactivation in boar spermatozoaポスター発表
- 第109回日本畜産学会大会, 2008年03月, 日本語, 日本畜産学会, 水戸市, 国内会議ウシ精子のハイパーアクチベーション発現制御に関与する候補分子の特定口頭発表（一般）
- 第100回日本繁殖生物学会大会, 2007年10月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 東京, 国内会議マウス精巣上体尾精子の鞭毛主部においてプロテインホスファターゼはPKA活性を抑制する口頭発表（一般）
- 第100回日本繁殖生物学会大会, 2007年10月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 東京, 国内会議ブタ精子頭部でのcAMP依存性細胞内カルシウム濃度上昇およびキャパシテーションにおけるEpacの役割口頭発表（一般）
- 第100回日本繁殖生物学会大会, 2007年10月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 東京, 国内会議ブタ精子の部位特異的な細胞内cAMPシグナリング：ハイパーアクチベーション誘起に伴う鞭毛主部でのPKAおよびPDK1のcAMP依存的な変化ポスター発表
- 第100回日本繁殖生物学会大会, 2007年10月, 日本語, 東京, 国内会議ウシ，ブタおよびマウスの精子でのタンパク質チロシンリン酸化に及ぼすcAMPアナログとタンパク質チロシンホスファターゼの影響ポスター発表
- 日本アンドロロジー学会第26回学術大会, 2007年07月, 日本語, 浦安市, 国内会議ブタ精子の部位特異的な細胞内cAMPシグナリング：頚部のcAMP-PKA-PKCシグナリングはハイパーアクチベーションの発現調節に関与する口頭発表（一般）
- 日本アンドロロジー学会第26回学術大会, 2007年07月, 日本語, 浦安市, 国内会議ウシおよびブタの精子におけるcAMP依存性タンパク質チロシンリン酸化口頭発表（一般）
- 環境科学総合研究所成果報告会, 2007年05月, 日本語, 熱海, 国内会議人間との共生環境の回復を目的とした有害野生動物の繁殖抑制公開講演，セミナー，チュートリアル，講習，講義等
- 日本畜産学会第107回大会, 2007年03月, 日本語, 相模原市, 国内会議凍結融解処理されたブタ精子における32 kDaチロシンリン酸化タンパク質Tyr32の出現メカニズム口頭発表（一般）
- 第100回日本繁殖生物学会大会, 2007年03月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 東京, 国内会議ブタ着床前胚におけるタイトジャンクション関連タンパク質―Occludin の発現性ポスター発表
- 日本畜産学会第107回大会, 2007年03月, 日本語, 相模原市, 国内会議ブタ精子のキャパシテーションにおけるcAMP-Epac-カルシウムシグナリングの役割口頭発表（一般）
- 33rd Annual Conference of the International Embryo Transfer Society, 2007年01月, 英語, Kyoto, JAPAN, 国際会議Localization of claudin family proteins in pig embryos during preimplantation developmentポスター発表
- 33rd Annual Conference of the International Embryo Transfer Society, 2007年01月, 英語, Kyoto, Japan, 国際会議Fertilization-related parameters of frozen-thawed spermatozoa from subfertile Japanese Black cattleポスター発表
- The 3rd Asian Reproductive Biotechnology Conference, 2006年11月, 英語, Asian Reproductive Biotechnology Conference, Hanoi, Vietnam, 国際会議Assembly of nuclear membrane proteins in bovine IVF and activated oocytes.口頭発表（招待・特別）
- 第99回日本繁殖生物学会大会, 2006年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 名古屋, 国内会議マウス精巣上体精子におけるcAMP-Epacシグナリング経路の検出ポスター発表
- 第99回日本繁殖生物学会大会, 2006年09月, 日本語, Japanese Society of Animal Reproduction, 名古屋, 国内会議ブタ精子におけるcAMP-PKAシグナリング依存的なPKCの活性化は鞭毛の超活性化運動の発現制御に関与する口頭発表（一般）
- 第99回日本繁殖生物学会大会, 2006年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 名古屋, 国内会議ブタおよびマウス着床前胚のタイトジャンクション関連タンパク質の発現性ポスター発表
- 第13回日本胚移植研究会, 2006年08月, 日本語, 日本胚移植研究会, 広島, 国内会議着床前胚におけるタイトジャンクション構造タンパク質Claudin-1の核移行性口頭発表（一般）
- 第56回関西畜産学会大会, 2006年08月, 日本語, 関西畜産学会, 大阪, 国内会議ブタ精子の頭部におけるcAMP依存性細胞内カルシウム濃度上昇に及ぼす炭酸水素ナトリウムおよびPKA阻害剤の影響口頭発表（一般）
- 31st Annual meeting of American Society of Andrology, 2006年04月, 英語, American Society of Andrology, Chicago, USA, 国際会議Role of protein kinase C in the cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent hyperactivation of boar spermatozoaポスター発表
- 日本畜産学会第106回大会, 2006年03月, 日本語, 日本畜産学会, 福岡, 国内会議低繁殖能力雄黒毛和種の凍結精子における時期尚早なキャパシテーション・先体反応ポスター発表
- 日本畜産学会第106回大会, 2006年03月, 日本語, 日本畜産学会, 福岡, 国内会議ブタ精子後帽部におけるSer/Thrリン酸化タンパク質のcAMP依存的減少に及ぼすcalyculin Aの影響ポスター発表
- 日本畜産学会第106回大会, 2006年03月, 日本語, 日本畜産学会, 福岡, 国内会議ブタおよびマウスの精子におけるCa2+ストアマーカータンパク質の検出口頭発表（一般）
- Kobe University The 21st Century COE Program Symposium: Japan-Taiwan Symposium on Cell Signaling and Gene Expression (Program and Abstract,18), 2005年11月, 英語, Kobe University COE Program "Signaling Mechanisms by Protein Modification Reactions", Kobe, 国際会議Low progressive motility and premature expression of fertilizing ability of frozen-thawed spermatozoa from subfertile Japanese Black cattle口頭発表（一般）
- 第98 回日本繁殖生物学会大会(J.Reprod. Dev., Vol. 51(Suppl.), j120), 2005年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 静岡, 国内会議低繁殖能力雄ウシ由来の凍結精子で認められる低前進運動性および時期尚早なキャパシテーション・先体反応ポスター発表
- 第98 回日本繁殖生物学会大会(J. Reprod. Dev., Vol.51(Suppl.),j89), 2005年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 静岡, 国内会議ブタ精子頭部におけるcAMP依存性細胞内カルシウム濃度上昇に及ぼすPKA 阻害剤の影響口頭発表（一般）
- 平成17 年度（第55 回）関西畜産学会大会(関西畜産学会報Vol. 157, 20), 2005年09月, 日本語, 関西畜産学会, 松山, 国内会議ブタ精子の後帽部におけるcAMP依存的な糖鎖およびリン酸化タンパク質の変化口頭発表（一般）
- 8th International Congress of Andrology (Int. J. Androl., Vol. 28(Suppl. 1), 79), 2005年06月, 英語, International Society of Andrology, Seoul, Korea, 国際会議Low progressive motility, low PKA activity and premature capacitation of frozen-thawed spermatozoa from subfertile bullsポスター発表
- 8th International Congress of Andrology (Int. J. Androl., Vol. 28(Suppl. 1), 78), 2005年06月, 英語, International Society of Andrology, Seoul, Korea, 国際会議A cyclic AMP-dependent tyrosine phosphorylation of phospholipase C in boar spermatozoa口頭発表（一般）
- 日本畜産学会第104 回大会(講演要旨集、124), 2005年03月, 日本語, 日本畜産学会, 東京, 国内会議マウス精子におけるcAMP シグナリング経路の解析口頭発表（一般）
- 日本畜産学会第104回大会(講演要旨集、124), 2005年03月, 日本語, 日本畜産学会, 東京, 国内会議ブタ精子のcAMP依存的チロシンキナーゼによるホスホリパーゼCγ1 の活性化口頭発表（一般）
- 第82回日本養豚学会大会, 2004年10月, 日本語, 日本養豚学会, 家畜改良センター, 国内会議ブタ精子チロシンキナーゼSYKの活性化はカルシウム非依存性cAMPシグナリングにより制御される口頭発表（一般）
- 第97回日本繁殖生物学会大会, 2004年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 広島, 国内会議ブタ精子の非受容体型チロシンキナーゼSYKにおけるcAMP依存的活性化ポスター発表
- 第97回日本繁殖生物学会大会, 2004年09月, 日本語, 日本繁殖生物学会, 広島, 国内会議キャパシテーション過程のブタ精子におけるPKA基質タンパク質のリン酸化口頭発表（一般）
- 第11回日本胚移植研究会大会, 2004年08月, 日本語, 日本胚移植研究会, 松山, 国内会議ウシ体外受精卵母細胞の核膜形成ならびにヒストンH3の脱リン酸化状態による前核形成異常の検出口頭発表（一般）
- The American Society of Andrology, 29th Annual Meeting., 2004年04月, 英語, The American Society of Andrology, USA, Baltimore, 国際会議cAMP-induced increase of 32-kDa tyrosine-phosphorylated protein (TyrP32) is related to the calcium-dependent disintegration of the acrosome in boar sperm.ポスター発表
- 日本畜産学会第103回大会, 2004年03月, 日本語, 日本畜産学会, 東京農工大学, 国内会議ウシ受精卵母細胞におけるLys9でメチル化されているヒストンH3の局在性口頭発表（一般）
- 日本畜産学会第103回大会, 2004年03月, 日本語, 日本畜産学会, 東京農工大学, 国内会議cAMPによりブタ精子で誘起されるTyrP32の増加および先体崩壊におけるカルシウムの役割口頭発表（一般）
- 第27回日本分子生物学会年会, 2004年, 日本語, 日本分子生物学会, 未記入, 国内会議ウシ受精ならびに活性化卵母細胞におけるLAP2βの局在とその凝集時期口頭発表（一般）
- The AmericanSociety of Andrology 28th Annual Meeting,, 2003年, 英語, 未記入, Washington. DC, 国際会議Viability and protein phosphorylation state of boar sperm undergoing cAMP analogue-induced head-to-head agglutination口頭発表（一般）
- Theriogenology, 2003年, 英語, 未記入, 未記入, 国際会議Localization of LAP2beta in oocytes and embryos during early development in cattle, The Annual Conference of the International Embryo Transfer Society口頭発表（一般）
- 36th Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction, 2003年, 英語, 未記入, 未記入, 国際会議Behavior of chromatins in pronuclei in the cattle and mouse口頭発表（一般）
- 関西アンドロロジーカンファレンス
- 関西生殖医学集談会
- 精子研究会
- 日本生殖医学会
- The Society for the Study of Reproduction
- 関西畜産学会
- 日本アンドロロジー学会
- 日本繁殖生物学会
- 日本畜産学会
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(C), 神戸大学, 2022年04月 - 2025年03月ウシでの人工授精成績を向上させるための新規の精子鞭毛機能検査法の確立と普及
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(C), 大阪府立大学, 2021年04月 - 2025年03月雌ウシのINSL3分泌動態および生殖器・生殖細胞における受容体発現と役割の解明2021年度は、１）ウシの発情周期の主席卵胞と黄体および卵胞嚢腫のINSL3分泌能を調べることを目的とし、主席卵胞と嚢腫卵胞の卵胞液および黄体組織のINSL3と性ステロイド（テストステロン、エストラジオール-17β、プロジェステロン）量を解析するとともに、培養黄体細胞からのINSL3とプロジェステロンの分泌能を分析した。同時に、２）正常雌ウシと卵胞嚢腫牛の血中INSL3濃度の動態を解明するために、雌ウシの血中INSL3濃度を測定できるサンドイッチ時間分解蛍光免疫測定（TRFIA）法の開発に取り組んだ。 １）については、食肉処理場において雌ウシの卵巣を採取し、発情周期中の主席卵胞の卵胞液と黄体の黄体組織のINSL3と性ステロイド量を測定した。その結果、主席卵胞のINSL3分泌はその成熟にともなって増加することが示唆された。卵胞のテストステロンとエストラジオール-17β量は卵胞の嚢腫化により低下するが、INSL3量は増加することが示唆された。黄体組織のINSL3とプロジェステロン含量はその開花期に増加することが示された。一方、黄体から黄体細胞を分離して培養し、培養液のINSL3濃度を測定した結果、INSL3分泌能は開花期に上昇するが、その分泌は黄体形成ホルモン（LH）に依存しないことが示された。 ２）については、サンドイッチTRFIA法に必要な検出用の抗ウシINSL3ペプチド抗体を作成し、そのビオチン標識を実施した。さらに補足用ウシINSL3抗体、ウシINSL3標準品、ビオチン標識検出用抗体およびユーロピウム標識ストレプトアビジンを用いてサンドイッチTRFIAの測定法の諸条件の検討を行った。その結果、最小検出濃度が0.1 ng/mLの高感度測定法を確立することができた。雌ウシ血漿サンプルを本法で測定したところ、血中INSL3濃度を無抽出で測定できることが判明した。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(B), 2020年04月 - 2024年03月融合因子SOFの機能解析を通した精子－卵子の細胞膜融合機構の解明sperm-oocyte fusion required (SOF)2～3を特異的に認識する抗体を得ることができなかったが、バックアッププランとして作製していたSOF2や3のC末端側にアフィニティータグを融合させたタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いて、免疫染色法によりSOF2や3が先体反応後の精子頭部に局在することを明らかにできた。さらに、IP/MS解析によりSOF2や3と相互作用する因子の同定にも成功した。そこで、マウスの心臓、肝臓、脾臓、腎臓、脳、精巣、卵巣、および子宮を採取し、得られた各組織由来のcDNAを使ってPCRを行ったところ、これらの遺伝子は精巣や精巣上体で発現することが明らかになった。
正常および低繁殖症を示す雄ウシの生殖細胞（精巣や成熟精子など）を採取して、ウェスタンブロティングを行ったところ、両者の間で差がある受精関連遺伝子を見出した。
マウス既知融合関連遺伝子の機能が種を超えて保存されているかを調べる目的で、他動物種の融合関連遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの作製に成功した。 - 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽), 挑戦的研究(萌芽), 神戸大学, 2019年06月 - 2021年03月, 研究代表者ウシ精子の鞭毛機能の評価基準の見直しを目的とした3次元ローテーション運動の解析本研究では，ウシ凍結保存射出精子用の鞭毛機能検査法の評価項目（新規候補）「3次元ローテーション」について，発生機構の解明，生物学的な位置づけ，および利用の検討を行い，次の成果を得た。 （1.発生機構）凍結保存に伴う3次元ローテーションの発生に，頸部細胞内Ca2+ストアのタプシガルギン感受性Ca2+ポンプにおける機能の低下，およびそれに伴う細胞内Ca2+濃度の上昇が関与することを示した。（2.位置づけ）3次元ローテーションが受精能獲得途上の精子で観察される運動様式であることを示唆した。（3.利用）鞭毛機能検査法での新規の評価項目として3次元ローテーションが有用である可能性を示した。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 岐阜大学, 2017年04月 - 2020年03月, 研究分担者コレステロールによるブタ夏季不妊症精子の治療効果メカニズムの解明豚の夏季不妊症では，夏季に精子の受精能獲得が時期尚早に発現し，タイムリーに受精に関与できなくなることにより受胎性が低下することが示唆されている．先行研究では，精液の冷蔵保存中にコレステロールを添加することにより，時期尚早の受精能獲得発現を減少させることが示されているが，その機序が未解明であったので，本研究では，この解明を目的としている．昨年度は保存後カルシウムイオノホアにより誘起した先体反応進行中におけるシグナル分子である cAMP とジアシルグリセロール（DAG）の変化を解析していたが，シグナル分子として DAG の分離と定量を行ったところ，未知のバンドが検出されたので，分離方法の再検討を行った．本年度は，分離方法（展開溶媒及び展開方法）を改善し問題を解決した． 一方，豚精子の夏季における時期尚早の受精能獲得を緩和する目的で，コレステロール以外の物質を検討した結果，硫酸マグネシウムあるいは塩化マグネシウムを保存中あるいは保存後洗浄した精子へ添加した場合，カルシウムイオノホアにより誘起された先体反応を遅延させることが明らかになった．また，同様に受精能獲得を遅延させることのできる物質の候補としてカルモジュリンやタンパクキナーゼCの阻害剤であるポリミキシンBを保存中あるいは保存後洗浄した精子へ添加した結果，カルシウムイオノホアにより誘起された先体反応は逆に増強された． 本年度は cAMP アナログである cBiMPS により誘起したハイパーアクチベーションへ及ぼす保存中のコレステロール添加の影響に関する検討目的としていたが，比較の目的で牛凍結融解精子を用いて，cBiMPS によるハイパーアクチベーション誘起を行ったところ，誘起率が低い個体の存在することが明らかとなった．このことから，豚精子のハイパーアクチベーション誘起においてサンプル間の差を考慮に入れる必要があると思われた．
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 神戸大学, 2016年04月 - 2019年03月, 研究代表者ウシ凍結前精子の耐凍能判定法の確立を目的としたSPACA1タンパク質の解析と利用本研究の目的は，ウシ凍結前精子の先体耐凍能判定法を確立すること，およびこの判定法を普及させるための基盤づくり（技術的信頼性の構築）であった。本研究での取り組みにより，SPACA1タンパク質の分布状態を指標とするウシ（黒毛和種）新鮮射出精子の耐凍能判定法を開発した。またSPACA1タンパク質の分布異常は精巣上体の通過時における精子の成熟変化の不全と関連すること，およびSPACA1タンパク質の正常分布率の低い凍結保存精子を人工授精に使用した際の雌ウシの低受胎は精子の受精能力の低さに起因することを示唆した。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 岐阜大学, 2014年04月 - 2017年03月, 研究分担者ブタ夏季不妊症精子の発症要因解析と新規治療法の開発夏季にブタ精子の先体反応が過敏誘起される原因の一つは精子内cAMP 濃度 （[cAMP]i ）が上昇することであると思われた．希釈液へのコレステロール添加あるいは希釈液からの重炭酸除去は冷蔵保存した精子の[cAMP]i に影響しなかった．コレステロール添加が先体反応を遅延する機序は，反応進行中である可能性が考えられた．マグネシウムの添加は先体反応を濃度依存的に低下させた．FITC-PNA 染色の方法に改良を加えた． 脂肪幹細胞の存在下で前培養した精子は体外受精能力が上昇した．今後コレステロール，マグネシウムおよび脂肪幹細胞が夏季不妊症精子の治療へ応用される可能性が切り開かれた．
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(B), 基盤研究(B), 神戸大学, 2013年04月 - 2016年03月, 研究分担者ブタ着床前発生胚におけるシーリングタンパク質クローディンの発現性と胚の発生能ブタ胚盤胞はclaudin-1, -4, -6, -7, -8, -9, -12, -14を発現し，claudin-4, -6, -7はTJ上に，他のclaudinsは細胞質性のTJ異所性に分布しており，ブタ胚盤胞には claudin-4, -6, -7が重要である。claudin-1, -4のKDは初期分割率を著しく低下させることが分かった。 claudinsの発現変化から胚の潜在的発生能力を評価するための基礎データとして，ブタ着床前発生によるグルコースの代謝特性を調べ，糖質代謝特性は4細胞前後で異なること，ヘキソース生合成経路とGlcNAc修飾が着床前発生に重要な役割を持つことが分かった。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 神戸大学, 2013年04月 - 2016年03月, 研究代表者受精能力制御因子で派生する欠陥分子をマーカーとする家畜精子の分子性状検査法の開発本研究の目的は，家畜の人工授精で雌を受胎させにくい精子を産生する雄個体（低繁殖症雄個体）を正確に選び出すための新しい精子分子性状検査法の開発であった。本研究での取り組みにより，ウシ（黒毛和種）の凍結保存精子および新鮮射出精子における先体チロシンリン酸化タンパク質の分布状態を指標とする検査法の開発に成功した。またこの検査法により人工授精および体外受精での成績を予測できることを示した。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 挑戦的萌芽研究, 挑戦的萌芽研究, 神戸大学, 2011年 - 2012年, 研究代表者ブタおよびマウスの精子の育て直し処理による体外保存耐性の強化哺乳類精子の耐凍性には大きな動物種間差が存在する。ウシでは精子の高い耐凍性により,産子生産のための人工授精プログラムに凍結精液を利用できる。本研究では,ウシ精子に高い耐凍性をもたらす精巣上体成熟に伴う精子細胞膜の安定化の分子メカニズムを示唆した。また,この分子メカニズムに基づき精子の耐凍性を向上させるための体外培養系の開発を試みた。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 岐阜大学, 2009年 - 2011年, 研究分担者ブタの夏季不妊症を引き起こす精子の受精機能不全に対する臨床的治療法の開発夏季に悪化するブタ精液性状を改善し,年間を通して安定的な精液の供給およびひいては安定的な豚肉生産を確保するための方法を開発することを目的として,ブタにおける希釈液の改良および比較の目的でウシ凍結融解精子の性状を検査する新規方法の開発とその受精能力を上昇させる方法を検討した.その結果,改良したブタ希釈液により受胎率が上昇し,ウシ精子の新規検査法を見いだし,また,ウシ精液の凍結に使用する希釈液を改良することにより精子機能の改善が可能であった.
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 神戸大学, 2008年 - 2010年, 研究代表者家畜の雄性不妊症を引き起こす精子の受精機能不全に対する分子標的治療法の開発家畜繁殖の最初のステップである体内受精が成功するためには,精子は正確なタイミングで受精能力を発現しなければならない。本研究では,家畜の雄性低繁殖症を引き起こす時期尚早な精子の受精能力の発現を分子レベルで抑制するための有効なターゲットを,細胞内情報伝達系や糖代謝制御系の中核分子に見出した。また雄性低繁殖症雄個体由来の精子での構造的脆弱性にタンパク質のチロシンリン酸化不全が関与することを示唆した。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 神戸大学, 2006年 - 2007年, 研究代表者精子鞭毛の超活性化運動能力を指標とした黒毛和種の繁殖能力評価法の開発H18年度検討内容(1):様々な濃度のcBiMPSを含むBO-H液に精子を浮遊させ,38.5℃で1〜3時間インキュベートしたところ,0.1mM cBiMPS添加およびインキュベーション3時間が好適で,37%の精子で鞭毛超活性化運動(HA)が誘起された。この結果はcAMPシグナリングを活性化することにより黒毛和種精子で効率的にHAを誘起できることを実証している。 H18年度検討内容(2)と(3):上述の好適条件で処理した精子では少なくとも9種類のタンパク質でcAMP依存的なチロシンリン酸化(pY)反応が認められたが,pYの程度はブタ精子よりかなり低レベルであった。また黒毛和種精子ではcAMP-PKA-SYKシグナリングは検出されなかったが,これとは別にcAMP-FAK様pYタンパク質シグナリングが存在することを指摘した。以上の結果は,黒毛和種精子でのHAがブタ精子とは異なる細胞内シグナリングにより制御されることを示唆している。 H19年度検討内容(1):岐阜県産低繁殖症個体の精子ではcBiMPSに対する反応(HAへの変化途上の運動様式円運動の発現)に明瞭な遅延が見られ,この遅延を調べることで個体の繁殖能力を予測できる可能性を見出した。他方,兵庫県産低繁殖症個体の精子では上述の遅延現象を見出せなかったが,精子の運動保持性が繁殖能力評価法の生物学的指標となりうることを示唆した。 H19年度検討内容(2):高HA精子では105kDaと130kDaのpYタンパク質が対照区(中HA精子)よりも有意に高い強度で検出された。また,94kDapYタンパク質も高HA精子でより強く検出される傾向にあった。つまり,これらのpYタンパク質は繁殖能力評価法の生化学的指標になりうる分子である。なお94kDapYタンパク質は鞭毛主部に分布するFAK様タンパク質として同定した。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 神戸大学, 2004年 - 2005年, 研究代表者ブタ胚生産システムの確立を目的とした精子受精能力発現の人為的抑制法の開発1.cAMP依存性PTKの同定:精子の頚部と鞭毛主部ではSYKがcAMP-PKAシグナリング依存的に活性化されることを見出した。この活性化機構はリンパ球での機構と全く相違することから,精子SYKの活性化は新規の機序により制御されていると考えられる。 2.SYKの活性化と精子受精能力発現状態との相関性の観察:活性化型SYKが出現するcAMPアナログ処理2〜3時間後の精子では超活性化運動の発現が認められた。超活性化運動は精子の卵母細胞への侵入に必要な推進力を生み出すという事実を考え合わせると,SYKは精子の受精能力発現制御因子のひとつといえる。 3.精巣SYKのcDNA配列解析:精巣cDNAを鋳型として増幅したPCR産物(590塩基)は脾臓由来syk遺伝子のC末端触媒領域の配列と完全に一致した。これは精巣でSYKが産生されることを実証している。 4.精子SYK基質分子の特定と機能解析:精子SYKの基質分子はPLCγ1であった。SYKは自身のY352をcAMP依存的にリン酸化することでPLCγ1と結合可能となり,その後にPLCγ1に対してY783をリン酸化することで活性化を誘起することを示した。また,U-73122によるPLCγ1活性の化学的阻害は鞭毛での受精能力の過剰発現の抑制に有効なことを見出した。 5.PLCγ1ペプチド断片の精子への導入法の検討:2種類の市販キットを用いて検討したが,いずれも試薬や導入操作に精子の運動を低下させる要因が存在し,本研究の条件を満たすペプチド導入法を見出せなかった。 6.SYK-PLCγ1以外の精子受精能力発現制御因子の特定と機能解析:cAMP-PKAシグナリングの下流因子としてPKCが見出された。またPKC活性をRo-32-0432で化学的に阻害することで,鞭毛での受精能力過剰発現を適度に抑制できることを明らかにした。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(B), 基盤研究(B), 神戸大学, 1999年 - 2001年, 研究分担者ブタ精子の受精能獲得過程におけるAnti-Agglutininの動態および機能本研究では,1.受精能獲得に伴う精子結合Anti-Agglutinin(AA)の動態,2.AAの精製方法の検討ならびに媒液へのAA含有精漿成分の添加が精子の受精能獲得に及ぼす影響,および3.精子の頭部間凝集を制御する細胞内情報伝達経路の3テーマについて検討し,テーマ1および3において有意義な結果が得られた。本要約ではこれらの2テーマの概要を示す。 受精能獲得誘起処理に伴う精子結合AAの変化を観察した。ウエスタンブロッティングにより検出されたAAをデンシトメーターで解析したところ,精子結合AAは処理開始当初の45分間で処理前の試料の約半分まで減少したが,その後の減少は緩慢であった。間接蛍光抗体法による観察結果によると,処理に伴う精子結合AAの減少は精子頭部の先体において認められた。以上の結果から,精子結合AAの多くは受精能獲得過程の初期段階において精子先体から解離することが明らかになった。 精子での頭部間凝集反応において炭酸水素イオン・アデニール酸シクラーゼ(AC)・cAMP・タンパク質キナーゼ(PK)系が果たす役割について頭部間凝集アッセイにより検討した。試料に100μM forskolin(AC活性化剤)を添加した場合の凝集精子率は対照区と比べて有意に高い値であった。またforskolinの代りにPKA活性化剤のdbcAMP(1〜1,000μM)を添加すると,凝集精子率は濃度依存的に有意に上昇した。しかしながら,dbcAMP(1,000μM)とともに,PKA阻害剤のRp-cAMPS(1,000μM)またはH-89(5μM)を添加すると,dbcAMPの作用により上昇した凝集精子率は優位に低下した。以上の結果から,炭酸水素イオン・AC・cAMP・PK系は精子の頭部間凝集を制御する細胞内情報伝達経路として機能すると考えられる。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 奨励研究(A), 奨励研究(A), 神戸大学, 1999年 - 2000年, 研究代表者ブタ精子のキャパシテーション過程での頭部間凝集に及ぼすカルシウムの影響実験1.カルモジュリン(CaM)の役割:既報(Chan and Dukelow,1985;Leclerc et al.,1990,1992)によると,精子におけるCaM濃度およびCaMの特異タンパク質への結合性はキャパシテーションとともに低下することから,CaMはキャパシテーションに抑制的に作用していると推察されている.そこで,本研究では成分からキャパシテーション誘起因子を除去した媒液中で精子をインキュベートした際のCaM阻害剤の影響について検討した.予備実験においてCalmidazoliumとTrifluoperazineを用いたが,これらの薬剤は精子に対する毒性が強く,本実験での使用には不適切であった.そこで,比較的毒性の低かったW7(5〜10μM)を用いたところ,頭部間凝集精子率は著しく上昇した.この結果から,CaMは精子の頭部間凝集に抑制的に作用していると考えられる. 実験2.電位依存性カルシウムチャンネル(VDCCs)の役割:昨年度の研究において10〜100μMの濃度では精子の頭部間凝集に有意な抑制作用を示さなかったL型VDCCs阻害剤のNifedipineとNitrendipineをより高い濃度(1mM)で添加したところ,頭部間凝集率は有意に低下した.他方,T型VDCCsの役割については,予備実験で精子に対する毒性が比較的少ないことが判明した阻害剤のPimozideとAmiloride(いずれも0.1〜10μM)を用いて検討したが,いずれも凝集精子率に有意な変動は認められなかった.以上の結果から,精子の頭部間凝集の発生においてVDCCsが機能している可能性が示唆されたが,L型阻害剤で抑制効果が認められた濃度は1mMと高く,またT型阻害剤(0.1〜10μM)には効果が認められなかったことから,VDCCsの種類を特定するには至っていない.
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(B), 基盤研究(B), 神戸大学, 1997年 - 1999年, 研究分担者ブタ活性化卵子の初期発生能ならびに単為発生胚の初期胚特異タンパク質の発現性電気刺激により高率に活性化したブタ単為発生2倍体を用いて,1.ブタ初期胚の培養系を確立するために,浸透圧,アミノ酸の胚盤胞への発生に及ぼす影響,2.単為発生2倍体の体内発生限界と単為発生胎子の生産効率,3.ブタにおけるインプリント侯補遺伝子の単為発生胎子における発現性の3点について検討し,以下の点について明らかにした。 1.(1)全培養期間同一の培地を使用する場合,等浸透圧系培地(309mOsm)では,コンパクションならびに胚盤胞形成が阻害され,低浸透圧(256mOsm)系培地の方が適している。これはNa+/K+比の問題ではなく,たんに浸透圧の影響である。(2)活性化48時間までは,逆に等浸透圧系(280〜320mOsmol)の方が分割率が高く,72時間以降は低浸透圧(220〜270mOsmol)の方が適している。(3)培養液に含まれるウシ血清アルブミン(BSA)を合成高分子化合物の0.5mg/ml以上のポリビニルアルコール(PVA)に置換しても,胚盤胞までの発生率はBSAと同等であるが,拡張胚盤胞に発生する胚はPVAでは有意に低い。(4)必須(EA)ならびに非必須(NEA)アミノ酸の混合液(AA)を培養の初めから添加すると著しい。4-細胞ブロックが誘起され,無添加より発生率が低い。これはEAの添加が原因で,NEAはEAの4-細胞ブロックを緩和する。 2.(1)ブタ単為発生体は,体内で着床初期の25日齢胎子までの高い発生能力(41%)を示すが,発育遅延,小頭,尿嚢発育遅延などの異常が認められる。(2)28〜29日齢に流産が起こりやすく,体内での発生限界は30日付近である。(3)NMR画像により,頭部に泡状構造の存在が示唆されている。 3.25日齢の2倍体単為発生胎子におけるインプリント候補遺伝子の発現性を検討した結果,(1)マウスやヒトで明らかになっている大部分のインプリント関連遺伝子の配列が,ブタでは不明なことから,PCR用プローブを検討した結果,p57KIP2,PEG1/MEST,SNRPN,H19の4つの遺伝子においてブタ正常胎子からの増幅産物が得られる。(2)配列既知のIGF2,IGF2R,WT1ならびに上記の4つの遺伝子について,ノーザンハイブリダイゼーションと半定量的PCR法により正常と単為発生胎子で比較したところ,IGF2は単為発生で発現量がかなり低く,父性発現を示唆し,p57KIP2では同等であることから,母性発現,もしくは非インプリントを示唆している。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(B), 基盤研究(B), 神戸大学, 1997年 - 1999年, 研究分担者ブタ未発育卵母細胞からの胚生産技術の開発に関する研究本研究は,ブタ卵巣内に存在する多数の未発育卵母細胞を体外培養により発育させ,成熟卵母細胞として有効に利用する技術を開発する目的で行われた。屠体または生体から得たブタ卵巣を用い,それより採取した卵胞をコラーゲンゲルに包埋し,ウシ胎児血清,FSH,エストラジオールを含むウエイマス培地を基本培地として発育培養を行った。ついで,卵胞から卵母細胞-卵丘細胞複合体を切り出し,成熟培養と体外受精に供した。得られた主な結果は,次の通りである。 直径75μm以下の卵母細胞を体外で発育させるべく,発育培地の組成の改変をいくつか試みたが,いずれの培地においても有意な効果を得るにはいたらなかった。卵母細胞のサイズと発育・成熟・受精能力の関係については,受精卵子を得るための最小サイズは,本研究の発育培養条件を用いる限り,90μm前後であると推定された。また,卵母細胞の体外発育においては卵母細胞と顆粒膜細胞との相互作用が重要な働きをすることも明らかにされた。卵胞腔形成については,初期胞状卵胞から切り取った卵母細胞-卵丘細胞-顆粒膜細胞複合体であっても,コラーゲンゲルに包埋してFSHの存在下で培養すれば,再構築されること,その間に顆粒膜細胞内のcAMP含量が増加することや,培地にdbcAMPを加えても卵胞腔形成が誘起されるが,エストラジオール-17 βは無効であることなどを明らかにし,FSHの刺激によって顆粒膜細胞内で合成されたcAMPが顆粒膜細胞の増殖,形態変化,さらには卵胞液の分泌を促し,卵胞腔が形成されると結論した。さらに,卵母細胞の減数分裂再開過程においてcdc2キナーゼとMAPキナーゼの活性化が起こることや,cdc2キナーゼあるいはカゼインキナーゼを阻害すると,減数分裂の再開が起こらないことなどを明確にした。MPF活性の阻害因子であるweelキナーゼ活性は,卵母細胞が最大サイズになると急激に上昇するが,第二減数分裂中期で再び低下する。また,減数分裂過程におけるγ-tubulin,nuclear mitotic aparatus protein(NuMA)の局在,受精の過程でサイクリンB1の分解がMAPキナーゼの脱リン酸化に先立って起こることなど,興味ある基礎的知見が得られた。これらは,卵母細胞の発育-成熟培養系の開発に大きく寄与する貴重な資料と考えられる。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 奨励研究(A), 奨励研究(A), 神戸大学, 1997年 - 1998年, 研究代表者Anti-Agglutinin出現機序の生化学的および免疫組織学的解析3頭の成熟雄ブタから採取した精巣上体を頭2部位,体2部位および尾1部位の合計5部位に区分し,パラホルムアルデヒド固定,凍結およびクリオスタットによる薄切の後に各部位でのAnti-Agglutininの分布を免疫組織学的に観察した。その結果,はじめてAnti-Agglutininが検出されたのは精巣上体の体近位部で,精巣上体管の上皮と管腔内容物の両方において認められた。また,精巣上体体遠位部においてもほぼ同様の検出結果が得られた。さらに,精巣上体尾の管腔内容物においてもAnti-Agglutininは検出されたが,管上皮にはほとんど認められなかった。他方,3頭の成熟雄ブタから12種類の臓器(精巣上体,精巣,精のう腺,前立腺,心臓,肝臓,腎臓,脾臓,胃,小腸,肺および筋肉)を採取し,臓器組織の一部を1mMAPMSF,1mMEDTAおよび1%TritonX-100添加リン酸緩衝生理食塩水中でホモジネートにした後,そのホモジネートを用いてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを行ったところ,Anti-Agglutininが検出されたのは精巣上体のみで,中でも精巣上体体において最も強い反応が得られた。以上の結果から,精巣上体においてAnti-Agglutininを生産および分泌する部位は体であると考えられる。なお,精巣上体管腔内に分泌されたAnti-Agglutininの一部は精子の先体と結合することを細胞免疫学的手法により合わせて明らかにした。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 奨励研究(A), 奨励研究(A), 神戸大学, 1996年 - 1996年, 研究代表者精巣上体液中の精子頭部間凝集抑制タンパク質を修飾する糖鎖の特性解析1.研究実績の概要:哺乳動物の精巣上体における精子の成熟変化のひとつである頭部間凝集性低下の分子機構を明らかにする目的で、精子頭部間凝集抑制タンパク質(Anti-Agglutinin:以下AAとする)を修飾する糖鎖の特性を解析し、以下の結果を得た。 2.糖鎖修飾の違いがAAの精子への結合性に及ぼす影響:AAにおいて、分子不均一性が精子への結合性に大きく影響するが、この分子不均一性の原因を明らかにする目的で、精巣上体尾液(30μg)を尿素存在下で2次元電気泳動した後、レクチンブロッティング法に従ってコムギ胚芽凝集素(WGA)との反応性について調べた。その結果、精子との結合性を備える等電点5.8のスポットはWGAと反応したが、精子と結合しない等電点5.6および5.95のスポットは反応しなかった。従って、糖鎖のシアル酸化の有無が分子不均一性の一因であり、また精子への結合性に影響すると考えられる。 3.修飾糖鎖の分子量測定:AAからGlycoFree-Kitを用いて糖鎖を完全に除去し、その際の分子量の変化をMALDI-TOF-Mass Spectrometric Analysisにより測定したところ、無処理のAAは分子量18900-19600においてブロードしたピークとして検出されたが、糖鎖除去後の試料は最高700小さい分子量においてシャープやピークを示した。このことから、総分子量で700以下の糖鎖がAAを修飾しており、その修飾糖鎖は多種類存在すると考えられる。 4.脱シアル酸がAAの生理活性に及ぼす影響:ノイラミニダーゼ(0.5U/ml)を用いて脱シアル酸化したAAを洗浄精子浮遊液に添加し37℃で5時間インキュベートしたところ、AAの精子凝集抑制作用は若干低下する傾向を示した。
研究シーズ
■ 研究シーズ- 家畜精子の受精制御分子の探索と利用シーズカテゴリ：環境・農学研究キーワード：畜産 人工授精 黒毛和種 精子研究の背景と目的：家畜（ウシおよびブタ）精子の受精メカニズムの解明を目的とし、家畜精子の受精を制御する分子を探索しています。また発見された受精制御分子をマーカーとして利用する「精子機能の精密検査法」を開発することで、家畜の繁殖成績（人工授精の受胎率）を向上させることを目指しています。研究内容：受精制御分子の探索：家畜精子には部位特異的な環状アデノシン1リン酸（cAMP）シグナル伝達経路が存在し、受精を制御していることを明らかにしました。またウシ精子では頸部のプロテインホスファターゼがcAMPシグナル伝達経路の調節に重要な役割を果たすことを見いだしました。 精子機能の精密検査法の開発：精巣上体での成熟とともに先体に配置されるチロシンリン酸化型Sperm associated 1（SPACA1）タンパク質をマーカーとする精子機能の精密検査法をウシにおいて確立しました。すなわち、この検査で不合格となったウシは低繁殖能力個体（凍結保存精子を用いた人工授精での成績が低い個体）と判別できます。また精密検査法のマーカーとして利用可能な分子として、mRNAのスプライシングエラーによりcAMPの合成能力が低下した異常型アデニル酸シクラーゼ10をウシ精子で見いだしました。
期待される効果や応用分野：家畜の繁殖（人工授精）成績および生産性を飛躍的に向上させることで、食肉や乳畜産製品の供給体制の改善に貢献できると期待しています。関係する業績：Harayama et al. Protein biomarkers for male artificial insemination subfertility in bovine spermatozoa. Reprod Med Biol. 2017 20;16(2):89-98. doi: 10.1002/rmb2.12021