研究活動情報

• 2018年10月 International Congress on Pure and Applied Chemistry Langkawi 2018, Plenary Lecture Award（International Congress on Pure and Applied Chemistry Langkawi 2018）, Membrane proteins in action; Structural and functional dynamics revealed by time-resolved measurements.

  KIMURA Tetsunari

  国際学会・会議・シンポジウム等の賞


• 2015年06月 日本蛋白質科学会, 蛋白質科学会若手奨励賞, マイクロ流体フローを用いた一酸化窒素還元酵素の触媒反応の動的分光観察

  木村 哲就

  日本国

  国内学会・会議・シンポジウム等の賞

• Oxygen-evolving photosystem II structures during S1-S2-S3 transitions.

  Hongjie Li, Yoshiki Nakajima, Eriko Nango, Shigeki Owada, Daichi Yamada, Kana Hashimoto, Fangjia Luo, Rie Tanaka, Fusamichi Akita, Koji Kato, Jungmin Kang, Yasunori Saitoh, Shunpei Kishi, Huaxin Yu, Naoki Matsubara, Hajime Fujii, Michihiro Sugahara, Mamoru Suzuki, Tetsuya Masuda, Tetsunari Kimura, Tran Nguyen Thao, Shinichiro Yonekura, Long-Jiang Yu, Takehiko Tosha, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takaki Hatsui, Makina Yabashi, Minoru Kubo, So Iwata, Hiroshi Isobe, Kizashi Yamaguchi, Michihiro Suga, Jian-Ren Shen

  Photosystem II (PSII) catalyses the oxidation of water through a four-step cycle of Si states (i = 0-4) at the Mn4CaO5 cluster1-3, during which an extra oxygen (O6) is incorporated at the S3 state to form a possible dioxygen4-7. Structural changes of the metal cluster and its environment during the S-state transitions have been studied on the microsecond timescale. Here we use pump-probe serial femtosecond crystallography to reveal the structural dynamics of PSII from nanoseconds to milliseconds after illumination with one flash (1F) or two flashes (2F). YZ, a tyrosine residue that connects the reaction centre P680 and the Mn4CaO5 cluster, showed structural changes on a nanosecond timescale, as did its surrounding amino acid residues and water molecules, reflecting the fast transfer of electrons and protons after flash illumination. Notably, one water molecule emerged in the vicinity of Glu189 of the D1 subunit of PSII (D1-E189), and was bound to the Ca2+ ion on a sub-microsecond timescale after 2F illumination. This water molecule disappeared later with the concomitant increase of O6, suggesting that it is the origin of O6. We also observed concerted movements of water molecules in the O1, O4 and Cl-1 channels and their surrounding amino acid residues to complete the sequence of electron transfer, proton release and substrate water delivery. These results provide crucial insights into the structural dynamics of PSII during S-state transitions as well as O-O bond formation.

  2024年02月, Nature, 626(7999) (7999), 670 - 677, 英語, 国際誌

  研究論文（学術雑誌）


• Trapping of a Mononitrosyl Nonheme Intermediate of Nitric Oxide Reductase by Cryo-Photolysis of Caged Nitric Oxide.

  Hanae Takeda, Kanji Shimba, Masaki Horitani, Tetsunari Kimura, Takashi Nomura, Minoru Kubo, Yoshitsugu Shiro, Takehiko Tosha

  Characterization of short-lived reaction intermediates is essential for elucidating the mechanism of the reaction catalyzed by metalloenzymes. Here, we demonstrated that the photolysis of a caged compound under cryogenic temperature followed by thermal annealing is an invaluable technique for trapping of short-lived reaction intermediates of metalloenzymes through the study of membrane-integrated nitric oxide reductase (NOR) that catalyzes reductive coupling of two NO molecules to N2O at its heme/nonheme FeB binuclear center. Although NO produced by the photolysis of caged NO did not react with NOR under cryogenic temperature, annealing to ∼160 K allowed NO to diffuse and react with NOR, which was evident from the appearance of EPR signals assignable to the S = 3/2 state. This indicates that the nonheme FeB-NO species can be trapped as the intermediate. Time-resolved IR spectroscopy with the use of the photolysis of caged NO as a reaction trigger showed that the intermediate formed at 10 μs gave the NO stretching frequency at 1683 cm-1 typical of nonheme Fe-NO, confirming that the combination of the cryo-photolysis of caged NO and annealing enabled us to trap the reaction intermediate. Thus, the cryo-photolysis of the caged compound has great potential for the characterization of short-lived reaction intermediates.

  2023年02月, The journal of physical chemistry. B, 127(4) (4), 846 - 854, 英語, 国際誌

  研究論文（学術雑誌）


• Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography

  Takashi Nomura, Tetsunari Kimura, Yusuke Kanematsu, Daichi Yamada, Keitaro Yamashita, Kunio Hirata, Go Ueno, Hironori Murakami, Tamao Hisano, Raika Yamagiwa, Hanae Takeda, Chai Gopalasingam, Ryota Kousaka, Sachiko Yanagisawa, Osami Shoji, Takashi Kumasaka, Masaki Yamamoto, Yu Takano, Hiroshi Sugimoto, Takehiko Tosha, Minoru Kubo, Yoshitsugu Shiro

  Nitric oxide (NO) reductase from the fungus Fusarium oxysporum is a P450-type enzyme (P450nor) that catalyzes the reduction of NO to nitrous oxide (N₂O) in the global nitrogen cycle. In this enzymatic reaction, the heme-bound NO is activated by the direct hydride transfer from NADH to generate a short-lived intermediate (I), a key state to promote N–N bond formation and N–O bond cleavage. This study applied time-resolved (TR) techniques in conjunction with photolabile-caged NO to gain direct experimental results for the characterization of the coordination and electronic structures of I. TR freeze-trap crystallography using an X-ray free electron laser (XFEL) reveals highly bent Fe–NO coordination in I, with an elongated Fe–NO bond length (Fe–NO = 1.91 Å, Fe–N–O = 138°) in the absence of NAD⁺. TR-infrared (IR) spectroscopy detects the formation of I with an N–O stretching frequency of 1,290 cm⁻¹ upon hydride transfer from NADH to the Fe³⁺–NO enzyme via the dissociation of NAD⁺ from a transient state, with an N–O stretching of 1,330 cm⁻¹ and a lifetime of ca. 16 ms. Quantum mechanics/molecular mechanics calculations, based on these crystallographic and IR spectroscopic results, demonstrate that the electronic structure of I is characterized by a singly protonated Fe³⁺–NHO^•− radical. The current findings provide conclusive evidence for the N₂O generation mechanism via a radical–radical coupling of the heme nitroxyl complex with the second NO molecule.

  Proceedings of the National Academy of Sciences, 2021年05月, Proceedings of the National Academy of Sciences, 118(21) (21), e2101481118 - e2101481118

  研究論文（学術雑誌）


• Capturing structural changes of the S1 to S2 transition of photosystem II using time-resolved serial femtosecond crystallography.

  Hongjie Li, Yoshiki Nakajima, Takashi Nomura, Michihiro Sugahara, Shinichiro Yonekura, Siu Kit Chan, Takanori Nakane, Takahiro Yamane, Yasufumi Umena, Mamoru Suzuki, Tetsuya Masuda, Taiki Motomura, Hisashi Naitow, Yoshinori Matsuura, Tetsunari Kimura, Kensuke Tono, Shigeki Owada, Yasumasa Joti, Rie Tanaka, Eriko Nango, Fusamichi Akita, Minoru Kubo, So Iwata, Jian-Ren Shen, Michihiro Suga

  Photosystem II (PSII) catalyzes light-induced water oxidation through an S i -state cycle, leading to the generation of di-oxygen, protons and electrons. Pump-probe time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) has been used to capture structural dynamics of light-sensitive proteins. In this approach, it is crucial to avoid light contamination in the samples when analyzing a particular reaction intermediate. Here, a method for determining a condition that avoids light contamination of the PSII microcrystals while minimizing sample consumption in TR-SFX is described. By swapping the pump and probe pulses with a very short delay between them, the structural changes that occur during the S1-to-S2 transition were examined and a boundary of the excitation region was accurately determined. With the sample flow rate and concomitant illumination conditions determined, the S2-state structure of PSII could be analyzed at room temperature, revealing the structural changes that occur during the S1-to-S2 transition at ambient temperature. Though the structure of the manganese cluster was similar to previous studies, the behaviors of the water molecules in the two channels (O1 and O4 channels) were found to be different. By comparing with the previous studies performed at low temperature or with a different delay time, the possible channels for water inlet and structural changes important for the water-splitting reaction were revealed.

  2021年05月, IUCrJ, 8(Pt 3) (Pt 3), 431 - 443, 英語, 国際誌

  研究論文（学術雑誌）


• Time-resolved serial femtosecond crystallography reveals early structural changes in channelrhodopsin.

  Kazumasa Oda, Takashi Nomura, Takanori Nakane, Keitaro Yamashita, Keiichi Inoue, Shota Ito, Johannes Vierock, Kunio Hirata, Andrés D Maturana, Kota Katayama, Tatsuya Ikuta, Itsuki Ishigami, Tamaki Izume, Rie Umeda, Ryuun Eguma, Satomi Oishi, Go Kasuya, Takafumi Kato, Tsukasa Kusakizako, Wataru Shihoya, Hiroto Shimada, Tomoyuki Takatsuji, Mizuki Takemoto, Reiya Taniguchi, Atsuhiro Tomita, Ryoki Nakamura, Masahiro Fukuda, Hirotake Miyauchi, Yongchan Lee, Eriko Nango, Rie Tanaka, Tomoyuki Tanaka, Michihiro Sugahara, Tetsunari Kimura, Tatsuro Shimamura, Takaaki Fujiwara, Yasuaki Yamanaka, Shigeki Owada, Yasumasa Joti, Kensuke Tono, Ryuichiro Ishitani, Shigehiko Hayashi, Hideki Kandori, Peter Hegemann, So Iwata, Minoru Kubo, Tomohiro Nishizawa, Osamu Nureki

  Channelrhodopsins (ChRs) are microbial light-gated ion channels utilized in optogenetics to control neural activity with light . Light absorption causes retinal chromophore isomerization and subsequent protein conformational changes visualized as optically distinguished intermediates, coupled with channel opening and closing. However, the detailed molecular events underlying channel gating remain unknown. We performed time-resolved serial femtosecond crystallographic analyses of ChR by using an X-ray free electron laser, which revealed conformational changes following photoactivation. The isomerized retinal adopts a twisted conformation and shifts toward the putative internal proton donor residues, consequently inducing an outward shift of TM3, as well as a local deformation in TM7. These early conformational changes in the pore-forming helices should be the triggers that lead to opening of the ion conducting pore.

  2021年03月, eLife, 10, 英語, 国際誌

  研究論文（学術雑誌）


• Role of Zinc Oxide Nanoparticles Synthesized by Fenugreek Seeds Extract as Anticancer Agent: In Vitro and In Vivo Studies.

  Aliaa M Radwan, Eman F Aboelfetoh, Tetsunari Kimura, Tarek M Mohamed, Mai M El-Keiy

  BACKGROUND: Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) are one of the metal oxide nanoparticles, which have attracted the interest of the researchers due to their biocompatibility, easily surface functionalization, and cancer targeting. OBJECTIVE: This study was designated to investigate the potential antitumor activity of the biologically synthesized ZnO NPs alone or in combination with doxorubicin using Ehrlich ascites carcinoma (EAC) model. METHODS: In this study, ZnO NPs were prepared by green approach using fenugreek seeds extract as reducing and capping agent then characterized by scanning electron microscope (SEM), energy dispersive x-ray (EDX), X-ray diffraction (XRD), UV-V spectroscopy, and transmission electron microscope (TEM). The prepared nanoparticles were tested for in vitro and in vivo studies using different parameters. RESULTS: Zinc oxide nanoparticles were determined to have cytotoxicity against different cancer cell lines with lower toxicity against normal one. Moreover, the in vivo study, demonstrated that the intraperitoneal injection of ZnO NPs alone or combined with doxorubicin in EAC mice inhibited the proliferation and growth of EAC by decreasing the ascetic volume and viable tumor cell count. This anti-proliferative efficiency of ZnO NPs was due to cell cycle arrest at G0/G1 phase and induction of apoptosis via upregulating the expression of caspase-3 and Bax and downregulating the expression of Bcl-2. CONCLUSION: Our findings indicated that the biologically synthesized ZnO NPs may be a promising nanomedicine therapy for cancer treatment in the future.

  2021年01月, Anti-cancer agents in medicinal chemistry, 英語, 国際誌

  研究論文（学術雑誌）


• Functional Assembly of Caenorhabditis elegans Cytochrome b-2 (Cecytb-2) into Phospholipid Bilayer Nanodisc with Enhanced Iron Reductase Activity.

  Hamed A Abosharaf, Yuki Sakamoto, Aliaa M Radwan, Keisuke Yuzu, Mika Fujimura, Thoria Diab, Tarek M Mohamed, Eri Chatani, Tetsunari Kimura, Motonari Tsubaki

  Among seven homologs of cytochrome b561 in a model organism C. elegans, Cecytb-2 was confirmed to be expressed in digestive organs and was considered as a homolog of human Dcytb functioning as a ferric reductase. Cecytb-2 protein was expressed in Pichia pastoris cells, purified, and reconstituted into a phospholipid bilayer nanodisc. The reconstituted Cecytb-2 in nanodisc environments was extremely stable and more reducible with ascorbate than in a detergent-micelle state. We confirmed the ferric reductase activity of Cecytb-2 by analyzing the oxidation of ferrous heme upon addition of ferric substrate under anaerobic conditions, where clear and saturable dependencies on the substrate concentrations following the Michaelis-Menten equation were observed. Further, we confirmed that the ferric substrate was converted to a ferrous state by using a nitroso-PSAP assay. Importantly, we observed that the ferric reductase activity of Cecytb-2 became enhanced in the phospholipid bilayer nanodisc.

  2021年01月, Biomolecules, 11(1) (1), 英語, 国際誌

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• Timing of NO Binding and Protonation in the Catalytic Reaction of Bacterial Nitric Oxide Reductase as Established by Time-Resolved Spectroscopy

  Hanae Takeda, Tetsunari Kimura, Takashi Nomura, Masaki Horitani, Azusa Yokota, Akiko Matsubayashi, Shoko Ishii, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo, Takehiko Tosha

  The Chemical Society of Japan, 2020年07月, Bulletin of the Chemical Society of Japan, 93(7) (7), 825 - 833

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Direct measurements of ferric reductase activity of human 101F6 and its enhancement upon reconstitution into phospholipid bilayer nanodisc.

  Mohammed El Behery, Mika Fujimura, Tetsunari Kimura, Motonari Tsubaki

  We studied human 101F6 protein to clarify its physiological function as a ferric reductase and its relationship to tumor suppression activity. We found for the first time that purified 101F6 both in detergent micelle state and in phospholipid bilayer nanodisc state has an authentic ferric reductase activity by single turnover kinetic analyses. The kinetic analysis on the ferrous heme oxidation of reduced 101F6 upon the addition of a ferric substrate, ferric ammonium citrate (FAC), showed concentration-dependent accelerations of its reaction with reasonable values of KM and Vmax. We further verified the authenticity of the ferric reductase activity of 101F6 using nitroso-PSAP as a Fe2+-specific colorimetric chelator. 101F6 in nanodisc state showed higher efficiency for FAC than in detergent micelle state.

  2020年03月, Biochemistry and biophysics reports, 21, 100730 - 100730, 英語, 国際誌

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）

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• An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser.

  Suga M, Akita F, Yamashita K, Nakajima Y, Ueno G, Li H, Yamane T, Hirata K, Umena Y, Yonekura S, Yu LJ, Murakami H, Nomura T, Kimura T, Kubo M, Baba S, Kumasaka T, Tono K, Yabashi M, Isobe H, Yamaguchi K, Yamamoto M, Ago H, Shen JR

  Photosynthetic water oxidation is catalyzed by the Mn4CaO5 cluster of photosystem II (PSII) with linear progression through five S-state intermediates (S-0 to S-4). To reveal the mechanism of water oxidation, we analyzed structures of PSII in the S-1, S-2, and S-3 states by x-ray free-electron laser serial crystallography. No insertion of water was found in S-2, but flipping of D1 Glu(189) upon transition to S-3 leads to the opening of a water channel and provides a space for incorporation of an additional oxygen ligand, resulting in an open cubane Mn4CaO6 cluster with an oxyl/oxo bridge. Structural changes of PSII between the different S states reveal cooperative action of substrate water access, proton release, and dioxygen formation in photosynthetic water oxidation.

  AMER ASSOC ADVANCEMENT SCIENCE, 2019年10月, Science (New York, N.Y.), 366(6463) (6463), 334 - 338, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Elucidation of molecular functions of human tumor suppressor protein 101F6 by reconstitution into phospholipid bilayer nanodiscs

  El Behery, Mohammed, 朝田 晃一, 武内 総子, 木村 哲就, 茶谷 絵理, 鍔木 基成

  Chemical Society of the Philippines, 2019年06月, KIMIKA Journal of the Kapisanang Kimika ng Pilipinas, 30(1) (1), 1 - 3, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）

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• Vibrational and Molecular Properties of Mg2+ Binding and Ion Selectivity in the Magnesium Channel MgtE

  Kimura, T, Lorenz-Fonfria, V.A, Douki, S, Motoki, H, Ishitani, R, Nureki, O, Higashi, M, Furutani, Y

  Magnesium ions (Mg2+) are crucial for various biological processes. A bacterial Mg2+ channel, MgtE, tightly regulates the intracellular Mg2+ concentration. Previous X-ray crystal structures showed that MgtE forms a dimeric structure composed of a total of 10 transmembrane α helices forming a central pore, and intracellular soluble domains constituting a Mg2+ sensor. The ion selectivity for Mg2+ over Ca2+ resides at a central cavity in the transmembrane pore of MgtE, involving a conserved aspartate residue (Asp432) from each monomer. Here, we applied ion-exchange-induced difference FTIR spectroscopy to analyze the interactions between MgtE and divalent cations, Mg2+ and Ca2+. Using site-directed mutagenesis, vibrational bands at 1421 (Mg2+), 1407 (Mg2+), ∼1440 (Ca2+), and 1390 (Ca2+) cm-1 were assigned to symmetric carboxylate stretching modes of Asp432, involved in the ion coordination. Conservative modifications of the central cavity by Asp432Glu or Ala417Leu mutations resulted in the disappearance of the Mg2+-sensitive carboxylate bands, suggesting a highly optimized geometry for accommodating a Mg2+ ion. The dependency of the vibrational changes on Mg2+ and Ca2+ concentrations revealed the presence of a two different classes of binding sites: a high affinity site for Mg2+ ( Kd ≈ 0.3 mM) with low Ca2+ affinity ( Kd ≈ 80 mM), and a medium affinity site for Mg2+ ( Kd ≈ 2 mM) and Ca2+ ( Kd ≈ 6 mM), tentatively assigned to the central cavity and the sensor domain, respectively. With the aid of molecular dynamics simulation and normal-mode analysis by quantum chemistry, we confirm that changes in carboxylate bands of the high affinity binding site originate from Asp432 in the central cavity.

  2018年10月, J. Phys. Chem. B, 122(42) (42), 9681 - 9696, 英語, 国際誌

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Vibrational and molecular properties of Mg2+ binding and selectivity in the magnesium channel MgtE

  Tetsunari KIMURA, Victor A, LORENZ-FONFRIA, Shintaro DOUKI, Hideyoshi MOTOKI, Ryuichiro ISHITANI, Osamu NUREKI, Masahiro HIGASHI, Yuji FURUTANI

  Magnesium ions (Mg2+) are crucial for various biological processes. A bacterial Mg2+ channel, MgtE, tightly regulates the intracellular Mg2+ concentration. Previous X-ray crystal structures showed that MgtE forms a dimeric structure composed of a total of 10 transmembrane α helices forming a central pore, and intracellular soluble domains constituting a Mg2+ sensor. The ion selectivity for Mg2+ over Ca2+ resides at a central cavity in the transmembrane pore of MgtE, involving a conserved aspartate residue (Asp432) from each monomer. Here, we applied ion-exchange-induced difference FTIR spectroscopy to analyze the interactions between MgtE and divalent cations, Mg2+ and Ca2+. Using site-directed mutagenesis, vibrational bands at 1421 (Mg2+), 1407 (Mg2+), ∼1440 (Ca2+), and 1390 (Ca2+) cm-1 were assigned to symmetric carboxylate stretching modes of Asp432, involved in the ion coordination. Conservative modifications of the central cavity by Asp432Glu or Ala417Leu mutations resulted in the disappearance of the Mg2+-sensitive carboxylate bands, suggesting a highly optimized geometry for accommodating a Mg2+ ion. The dependency of the vibrational changes on Mg2+ and Ca2+ concentrations revealed the presence of a two different classes of binding sites: a high affinity site for Mg2+ ( Kd ≈ 0.3 mM) with low Ca2+ affinity ( Kd ≈ 80 mM), and a medium affinity site for Mg2+ ( Kd ≈ 2 mM) and Ca2+ ( Kd ≈ 6 mM), tentatively assigned to the central cavity and the sensor domain, respectively. With the aid of molecular dynamics simulation and normal-mode analysis by quantum chemistry, we confirm that changes in carboxylate bands of the high affinity binding site originate from Asp432 in the central cavity.

  2018年, J. Phys. Chem. B., 122(42) (42), 9681 - 9696, 英語, 国際誌

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Ultraprecision cutting of single-crystal calcium fluoride for fabricating micro flow cells

  Ryo Komiya, Tetsunari Kimura, Takashi Nomura, Minoru Kubo, Jiwang Yan

  Single-crystal infrared (IR) spectroscopy is a promising method for protein structure analysis, where a protein crystal sample is fixed in a micro flow cell. Single-crystal calcium fluoride (CaF2) is expected as the flow cell substrate material for its excellent optical property. However, CaF2 is a highly brittle material having strong anisotropy, thus is extremely difficult to machine. Up to date, there is no available literature on fabrication of CaF2 flow cells. In this study, micro flow cells of single-crystal CaF2 were fabricated by ultraprecision cutting technology. Fly cutting was conducted using a single-crystal diamond tool having straight edges to generate a depth-varying rectangle cross section for the flow cell. The effects of cutting direction, workpiece orientation, undeformed chip thickness and tool rake angle on cutting behavior were investigated. Based on experiments and analysis, optimal conditions for ductile machining of micro grooves in CaF2 were identified. As a result, a 10 μm deep CaF2 micro flow cell with surface roughness of 2.4 nmRa was successfully fabricated. Using the fabricated flow cell, IR spectroscopic analysis of a protein single crystal at room temperature was succeeded. This study demonstrated the effectiveness of ultraprecision cutting technology in CaF2 micro flow cell fabrication, which contributes to the IR analysis of protein, and in turn, the advance of life science.

  Japan Society of Mechanical Engineers, 2018年, Journal of Advanced Mechanical Design, Systems and Manufacturing, 12(1) (1), JAMDSM0021, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate

  Takehiko Tosha, Takashi Nomura, Takuma Nishida, Naoya Saeki, Kouta Okubayashi, Raika Yamagiwa, Michihiro Sugahara, Takanori Nakane, Keitaro Yamashita, Kunio Hirata, Go Ueno, Tetsunari Kimura, Tamao Hisano, Kazumasa Muramoto, Hitomi Sawai, Hanae Takeda, Eiichi Mizohata, Ayumi Yamashita, Yusuke Kanematsu, Yu Takano, Eriko Nango, Rie Tanaka, Osamu Nureki, Osami Shoji, Yuka Ikemoto, Hironori Murakami, Shigeki Owada, Kensuke Tono, Makina Yabashi, Masaki Yamamoto, Hideo Ago, So Iwata, Hiroshi Sugimoto, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo

  Springer Science and Business Media LLC, 2017年12月, Nature Communications, 8(1) (1), 1585

  [査読有り]

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• Nanosecond pump-probe device for time-resolved serial femtosecond crystallography developed at SACLA

  Minoru Kubo, Eriko Nango, Kensuke Tono, Tetsunari Kimura, Shigeki Owada, Changyong Song, Fumitaka Mafuné, Ken Miyajima, Yoshihiro Takeda, Jun-Ya Kohno, Naoya Miyauchi, Takanori Nakane, Tomoyuki Tanaka, Takashi Nomura, Jan Davidsson, Rie Tanaka, Michio Murata, Takashi Kameshima, Takaki Hatsui, Yasumasa Joti, Richard Neutze, Makina Yabashi, So Iwata

  X-ray free-electron lasers (XFELs) have opened new opportunities for time-resolved X-ray crystallography. Here a nanosecond optical-pump XFEL-probe device developed for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) studies of photo-induced reactions in proteins at the SPring-8 Angstrom Compact free-electron LAser (SACLA) is reported. The optical-fiber-based system is a good choice for a quick setup in a limited beam time and allows pump illumination from two directions to achieve high excitation efficiency of protein microcrystals. Two types of injectors are used: one for extruding highly viscous samples such as lipidic cubic phase (LCP) and the other for pulsed liquid droplets. Under standard sample flow conditions from the viscous-sample injector, delay times from nanoseconds to tens of milliseconds are accessible, typical time scales required to study large protein conformational changes. A first demonstration of a TR-SFX experiment on bacteriorhodopsin in bicelle using a setup with a droplet-type injector is also presented.A nanosecond pump-probe device for time-resolved serial femtosecond crystallography has been developed at SACLA.

  International Union of Crystallography, 2017年09月, Journal of Synchrotron Radiation, 24(5) (5), 1086 - 1091, 英語

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• Nanosecond pump-probe device for time-resolved serial femtosecond crystallography developed at SACLA

  Minoru Kubo, Eriko Nango, Kensuke Tono, Tetsunari Kimura, Shigeki Owada, Changyong Song, Fumitaka Mafune, Ken Miyajima, Yoshihiro Takeda, Jun-ya Kohno, Naoya Miyauchi, Takanori Nakane, Tomoyuki Tanaka, Takashi Nomura, Jan Davidsson, Rie Tanaka, Michio Murata, Takashi Kameshima, Takaki Hatsui, Yasumasa Joti, Richard Neutze, Makina Yabashi, So Iwata

  X-ray free-electron lasers (XFELs) have opened new opportunities for timeresolved X-ray crystallography. Here a nanosecond optical-pump XFEL-probe device developed for time-resolved serial femtosecond crystallography (TRSFX) studies of photo-induced reactions in proteins at the SPring-8 Angstrom Compact free-electron LAser (SACLA) is reported. The optical-fiber-based system is a good choice for a quick setup in a limited beam time and allows pump illumination from two directions to achieve high excitation efficiency of protein microcrystals. Two types of injectors are used: one for extruding highly viscous samples such as lipidic cubic phase (LCP) and the other for pulsed liquid droplets. Under standard sample flow conditions from the viscous-sample injector, delay times from nanoseconds to tens of milliseconds are accessible, typical time scales required to study large protein conformational changes. A first demonstration of a TR-SFX experiment on bacteriorhodopsin in bicelle using a setup with a droplet-type injector is also presented.

  INT UNION CRYSTALLOGRAPHY, 2017年09月, JOURNAL OF SYNCHROTRON RADIATION, 24, 1086 - 1091, 英語

  [査読有り]

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• The Impact of the Polymer Chain Length on the Catalytic Activity of Poly(N-vinyl-2-pyrrolidone)-supported Gold Nanoclusters

  Setsiri Haesuwannakij, Tetsunari Kimura, Yuji Furutani, Kazu Okumura, Ken Kokubo, Takao Sakata, Hidehiro Yasuda, Yumi Yakiyama, Hidehiro Sakurai

  Poly(N-vinyl-2-pyrrolidone) (PVP) of varying molecular weight (M-w = 40-360 kDa) were employed to stabilize gold nanoclusters of varying size. The resulting Au:PVP clusters were subsequently used as catalysts for a kinetic study on the sized-dependent aerobic oxidation of 1-indanol, which was monitored by time-resolved in situ infrared spectroscopy. The obtained results suggest that the catalytic behaviour is intimately correlated to the size of the clusters, which in turn depends on the molecular weight of the PVPs. The highest catalytic activity was observed for clusters with a core size of similar to 7 nm, and the size of the cluster should increase with the molecular weight of the polymer in order to maintain optimal catalytic activity. Studies on the electronic and colloid structure of these clusters revealed that the negative charge density on the cluster surface also strongly depends on the molecular weight of the stabilizing polymers.

  NATURE PUBLISHING GROUP, 2017年08月, SCIENTIFIC REPORTS, 7(1) (1), 9579, 英語

  [査読有り]

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• A nanosecond time-resolved XFEL analysis of structural changes associated with CO release from cytochrome c oxidase

  Atsuhiro Shimada, Minoru Kubo, Seiki Baba, Keitaro Yamashita, Kunio Hirata, Go Ueno, Takashi Nomura, Tetsunari Kimura, Kyoko Shinzawa-Itoh, Junpei Baba, Keita Hatano, Yuki Eto, Akari Miyamoto, Hironori Murakami, Takashi Kumasaka, Shigeki Owada, Kensuke Tono, Makina Yabashi, Yoshihiro Yamaguchi, Sachiko Yanagisawa, Miyuki Sakaguchi, Takashi Ogura, Ryo Komiya, Jiwang Yan, Eiki Yamashita, Masaki Yamamoto, Hideo Ago, Shinya Yoshikawa, Tomitake Tsukihara

  Bovine cytochrome c oxidase (CcO), a 420-kDa membrane protein, pumps protons using electrostatic repulsion between protons transferred through a water channel and net positive charges created by oxidation of heme a (Fe-a) for reduction of O-2 at heme a(3) (Fe-a3). For this process to function properly, timing is essential: The channel must be closed after collection of the protons to be pumped and before Fea oxidation. If the channel were to remain open, spontaneous backflow of the collected protons would occur. For elucidation of the channel closure mechanism, the opening of the channel, which occurs upon release of CO from CcO, is investigated by newly developed time-resolved x-ray free-electron laser and infrared techniques with nanosecond time resolution. The opening process indicates that Cu-B senses completion of proton collection and binds O-2 before binding to Fe-a3 to close the water channel using a conformational relay system, which includes Cu-B, heme a(3), and a transmembrane helix, to block backflow of the collected protons.

  AMER ASSOC ADVANCEMENT SCIENCE, 2017年07月, SCIENCE ADVANCES, 3(7) (7), e1603042, 英語

  [査読有り]

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• Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL

  Michihiro Suga, Fusamichi Akita, Michihiro Sugahara, Minoru Kubo, Yoshiki Nakajima, Takanori Nakane, Keitaro Yamashita, Yasufumi Umena, Makoto Nakabayashi, Takahiro Yamane, Takamitsu Nakano, Mamoru Suzuki, Tetsuya Masuda, Shigeyuki Inoue, Tetsunari Kimura, Takashi Nomura, Shinichiro Yonekura, Long-Jiang Yu, Tomohiro Sakamoto, Taiki Motomura, Jing-Hua Chen, Yuki Kato, Takumi Noguchi, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takashi Kameshima, Takaki Hatsui, Eriko Nango, Rie Tanaka, Hisashi Naitow, Yoshinori Matsuura, Ayumi Yamashita, Masaki Yamamoto, Osamu Nureki, Makina Yabashi, Tetsuya Ishikawa, So Iwata, Jian-Ren Shen

  Photosystem II (PSII) is a huge membrane-protein complex consisting of 20 different subunits with a total molecular mass of 350 kDa for a monomer. It catalyses light-driven water oxidation at its catalytic centre, the oxygen-evolving complex (OEC)(1-3). The structure of PSII has been analysed at 1.9 angstrom resolution by synchrotron radiation X-rays, which revealed that the OEC is a Mn4CaO5 cluster organized in an asymmetric, `distorted-chair' form(4). This structure was further analysed with femtosecond X-ray free electron lasers (XFEL), providing the `radiation damage-free'(5) structure. The mechanism of O=O bond formation, however, remains obscure owing to the lack of intermediate-state structures. Here we describe the structural changes in PSII induced by two-flash illumination at room temperature at a resolution of 2.35 angstrom using time-resolved serial femtosecond crystallography with an XFEL provided by the SPring-8 angstrom compact free-electron laser. An isomorphous difference Fourier map between the two-flash and dark-adapted states revealed two areas of apparent changes: around the QB/non-haem iron and the Mn4CaO5 cluster. The changes around the QB/non-haem iron region reflected the electron and proton transfers induced by the two-flash illumination. In the region around the OEC, a water molecule located 3.5 angstrom from the Mn4CaO5 cluster disappeared from the map upon two-flash illumination. This reduced the distance between another water molecule and the oxygen atom O4, suggesting that proton transfer also occurred. Importantly, the two-flash-minus-dark isomorphous difference Fourier map showed an apparent positive peak around O5, a unique mu 4-oxo-bridge located in the quasi-centre of Mn1 and Mn4 (refs 4,5). This suggests the insertion of a new oxygen atom (O6) close to O5, providing an O=O distance of 1.5 angstrom between these two oxygen atoms. This provides a mechanism for the O=O bond formation consistent with that proposed previously(6,7.)

  NATURE PUBLISHING GROUP, 2017年03月, NATURE, 543(7643) (7643), 131 - +, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin

  Eriko Nango, Antoine Royant, Minoru Kubo, Takanori Nakane, Cecilia Wickstrand, Tetsunari Kimura, Tomoyuki Tanaka, Kensuke Tono, Changyong Song, Rie Tanaka, Toshi Arima, Ayumi Yamashita, Jun Kobayashi, Toshiaki Hosaka, Eiichi Mizohata, Przemyslaw Nogly, Michihiro Sugahara, Daewoong Nam, Takashi Nomura, Tatsuro Shimamura, Dohyun Im, Takaaki Fujiwara, Yasuaki Yamanaka, Byeonghyun Jeon, Tomohiro Nishizawa, Kazumasa Oda, Masahiro Fukuda, Rebecka Andersson, Petra Bath, Robert Dods, Jan Davidsson, Shigeru Matsuoka, Satoshi Kawatake, Michio Murata, Osamu Nureki, Shigeki Owada, Takashi Kameshima, Takaki Hatsui, Yasumasa Joti, Gebhard Schertler, Makina Yabashi, Ana-Nicoleta Bondar, Jorg Standfuss, Richard Neutze, So Iwata

  Bacteriorhodopsin (bR) is a light-driven proton pump and a model membrane transport protein. We used time-resolved serial femtosecond crystallography at an x-ray free electron laser to visualize conformational changes in bR from nanoseconds to milliseconds following photoactivation. An initially twisted retinal chromophore displaces a conserved tryptophan residue of transmembrane helix F on the cytoplasmic side of the protein while dislodging a key water molecule on the extracellular side. The resulting cascade of structural changes throughout the protein shows how motions are choreographed as bR transports protons uphill against a transmembrane concentration gradient.

  AMER ASSOC ADVANCEMENT SCIENCE, 2016年12月, SCIENCE, 354(6319) (6319), 1552 - 1557, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography

  Przemyslaw Nogly, Valerie Panneels, Garrett Nelson, Cornelius Gati, Tetsunari Kimura, Christopher Milne, Despina Milathianaki, Minoru Kubo, Wenting Wu, Chelsie Conrad, Jesse Coe, Richard Bean, Yun Zhao, Petra Bath, Robert Dods, Rajiv Harimoorthy, Kenneth R. Beyerlein, Jan Rheinberger, Daniel James, Daniel DePonte, Chufeng Li, Leonardo Sala, Garth J. Williams, Mark S. Hunter, Jason E. Koglin, Peter Berntsen, Eriko Nango, So Iwata, Henry N. Chapman, Petra Fromme, Matthias Frank, Rafael Abela, Sebastien Boutet, Anton Barty, Thomas A. White, Uwe Weierstall, John Spence, Richard Neutze, Gebhard Schertler, Jorg Standfuss

  Serial femtosecond crystallography (SFX) using X-ray free-electron laser sources is an emerging method with considerable potential for time-resolved pump-probe experiments. Here we present a lipidic cubic phase SFX structure of the light-driven proton pump bacteriorhodopsin (bR) to 2.3 angstrom resolution and a method to investigate protein dynamics with modest sample requirement. Time-resolved SFX (TR-SFX) with a pump-probe delay of 1ms yields difference Fourier maps compatible with the dark to M state transition of bR. Importantly, the method is very sample efficient and reduces sample consumption to about 1mg per collected time point. Accumulation of M intermediate within the crystal lattice is confirmed by time-resolved visible absorption spectroscopy. This study provides an important step towards characterizing the complete photocycle dynamics of retinal proteins and demonstrates the feasibility of a sample efficient viscous medium jet for TR-SFX.

  NATURE PUBLISHING GROUP, 2016年08月, NATURE COMMUNICATIONS, 7, 12314, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• A Study of the Dynamics of the Heme Pocket and C-helix in CooA upon CO Dissociation Using Time-Resolved Visible and UV Resonance Raman Spectroscopy

  Akihiro Otomo, Haruto Ishikawa, Misao Mizuno, Tetsunari Kimura, Minoru Kubo, Yoshitsugu Shiro, Shigetoshi Aono, Yasuhisa Mizutani

  CooA is a CO-sensing transcriptional activator from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum that binds CO at the heme iron. The heme iron in ferrous CooA has two axial ligands: His77 and Pro2. CO displaces Pro2 and induces a conformational change in CooA. The dissociation of CO and/or ligation of the Pro2 residue are believed to trigger structural changes in the protein. Visible time-resolved resonance Raman spectra obtained in this study indicated that the nu(Fe-His) mode, arising from the proximal His77 iron stretch, does not shift until 50 after the photodissociation of CO. Ligation of the Pro2 residue to the heme iron was observed around 50 its after the photodissociation of CO, suggesting that the nu(Fe-His) band exhibits no shift until the ligation of Pro2. UV resonance Raman spectra suggested structural changes in the vicinity of Trp110 in the C-helix upon binding, but no or very small spectral changes in the time-resolved UV resonance Raman spectra were observed from 100 ns to 100 its after the photodissociation of CO. These results strongly suggest that the conformational change of CooA is induced by the ligation of Pro2 to the heme iron.

  AMER CHEMICAL SOC, 2016年08月, JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B, 120(32) (32), 7836 - 7843, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• A nearly on-axis spectroscopic system for simultaneously measuring UV-visible absorption and X-ray diffraction in the SPring-8 structural genomics beamline

  Miyuki Sakaguchi, Tetsunari Kimura, Takuma Nishida, Takehiko Tosha, Hiroshi Sugimoto, Yoshihiro Yamaguchi, Sachiko Yanagisawa, Go Ueno, Hironori Murakami, Hideo Ago, Masaki Yamamoto, Takashi Ogura, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo

  UV-visible absorption spectroscopy is useful for probing the electronic and structural changes of protein active sites, and thus the on-line combination of X-ray diffraction and spectroscopic analysis is increasingly being applied. Herein, a novel absorption spectrometer was developed at SPring-8 BL26B2 with a nearly on-axis geometry between the X-ray and optical axes. A small prism mirror was placed near the X-ray beamstop to pass the light only 2 degrees off the X-ray beam, enabling spectroscopic analysis of the X-ray-exposed volume of a crystal during X-ray diffraction data collection. The spectrometer was applied to NO reductase, a heme enzyme that catalyzes NO reduction to N2O. Radiation damage to the heme was monitored in real time during X-ray irradiation by evaluating the absorption spectral changes. Moreover, NO binding to the heme was probed via caged NO photolysis with UV light, demonstrating the extended capability of the spectrometer for intermediate analysis.

  INT UNION CRYSTALLOGRAPHY, 2016年01月, JOURNAL OF SYNCHROTRON RADIATION, 23, 334 - 338, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Ultraprecision cutting of single-crystal calcium fluoride for fabricating micro flow cell for protein structure analysis

  Ryo Komiya, Tetsunari Kimura, Minoru Kubo, Jiwang Yan

  In infrared spectroscopic analysis of the structures of protein crystals, a micro-flow cell made of single crystal calcium fluoride (CaF2) is needed. In this research, fly cutting of micro grooves on a CaF2 substrate was conducted using a single-crystal diamond tool. The effects of cutting direction, up/down cut, and tool rake angle on ductile-brittle transition of cutting behavior were investigated. Based on the experimental results and analysis, optimal cutting conditions were selected which enabled ductile machining of CaF2. As a result, a 10 μm deep micro-flow cell was successfully fabricated with surface roughness of 2.4 nmRa. The availability of the flow cell was confirmed by visible absorption spectroscopy of protein.

  Japan Society of Mechanical Engineers, 2015年10月, Proceedings of the 8th International Conference on Leading Edge Manufacturing in 21st Century, LEM 2015, 英語

  研究論文（国際会議プロシーディングス）


• Chimeras of Channelrhodopsin-1 and-2 from Chlamydomonas reinhardtii Exhibit Distinctive Light-induced Structural Changes from Channelrhodopsin-2

  Asumi Inaguma, Hisao Tsukamoto, Hideaki E. Kato, Tetsunari Kimura, Toru Ishizuka, Satomi Oishi, Hiromu Yawo, Osamu Nureki, Yuji Furutani

  Channelrhodopsin-2 (ChR2) from the green alga Chlamydomonas reinhardtii functions as a light-gated cation channel that has been developed as an optogenetic tool to stimulate specific nerve cells in animals and control their behavior by illumination. The molecular mechanism of ChR2 has been extensively studied by a variety of spectroscopic methods, including light-induced difference Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, which is sensitive to structural changes in the protein upon light activation. An atomic structure of channelrhodopsin was recently determined by x-ray crystallography using a chimera of channelrhodopsin-1 (ChR1) and ChR2. Electrophysiological studies have shown that ChR1/ChR2 chimeras are less desensitized upon continuous illumination than native ChR2, implying that there are some structural differences between ChR2 and chimeras. In this study, we applied light-induced difference FTIR spectroscopy to ChR2 and ChR1/ChR2 chimeras to determine the molecular basis underlying these functional differences. Upon continuous illumination, ChR1/ChR2 chimeras exhibited structural changes distinct from those in ChR2. In particular, the protonation state of a glutamate residue, Glu-129 (Glu-90 in ChR2 numbering), in the ChR chimeras is not changed as dramatically as in ChR2. Moreover, using mutants stabilizing particular photointermediates as well as time-resolved measurements, we identified some differences between the major photointermediates of ChR2 and ChR1/ChR2 chimeras. Taken together, our data indicate that the gating and desensitizing processes in ChR1/ChR2 chimeras are different from those in ChR2 and that these differences should be considered in the rational design of new optogenetic tools based on channelrhodopsins.

  AMER SOC BIOCHEMISTRY MOLECULAR BIOLOGY INC, 2015年05月, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 290(18) (18), 11623 - 11634, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• New insights into metal ion-crown ether complexes revealed by SEIRA spectroscopy

  Yoshiya Inokuchi, Takayuki Ebata, Toshiaki Ikeda, Takeharu Haino, Tetsunari Kimura, Hao Guo, Yuji Furutani

  We demonstrate a powerful spectroscopic technique, surface-enhanced infrared absorption (SEIRA) spectroscopy, not only for detecting host-guest complexes in solution but also for examining the relationship between the guest selectivity, complex structure, and solvent effect. We synthesize thiol derivatives of 15-crown-5 and 18-crown-6 [2-(6-mercaptohexyloxy)methyl-15-crown-5 (15C5-C1OC6-SH) and 2-(6-mercaptohexyloxy) methyl-18-crown-6 (18C6-C1OC6-SH)], which are adsorbed on gold surfaces through S-Au bonds. The IR difference spectra of the M+center dot 15C5-C1OC6 (M = Li, Na, K, Rb, and Cs) complexes on gold are observed using aqueous solutions of MCl by SEIRA spectroscopy. The spectra show a noticeable change in the C-O stretching vibration at around 1100 cm(-1). The spectral patterns of M+center dot 15C5-C1OC6 are similar for Li+ and Na+, and for K+, Rb+, and Cs+; the interaction between the metal ions and 15C5-C1OC6 changes drastically between Na+ and K+ in the series of alkali metal ions. On the other hand, the equilibrium constant for complex formation determined by the IR intensity shows clear preference for Na+ ions. We also observe the IR difference spectra of M+center dot 18C6-C1OC6 in methanol and compare them with those in water. The spectral patterns in methanol are almost the same as those in water, but the equilibrium constant in methanol does not show preference for any ion, different from the K+ preference in water. From these findings we attribute the origin of the ion selectivity of 15C5 and 18C6 in solution to the interaction between the metal ions and the crown ethers in the complexes or the solvation energy of free ions. In the case of 15C5-C1OC6 in water, the preference of Na+ over K+, Rb+, and Cs+ can be attributed to the strength of the interaction or the size matching between metal ions and 15C5-C1OC6; the Na+ selectivity over Li+ ions is dominated by the solvation energy of free ions. For 18C6-C1OC6 in methanol, the equilibrium constant for complex formation becomes much bigger in methanol than that in water and loses the selectivity in methanol, because the solvation energy in methanol is fairly smaller than that in water, predominating the contribution from the strength of the interaction between metal ions and 18C6-C1OC6. The IR spectra measured by SEIRA spectroscopy are quite sensitive to properties of host-guest complexes such as the intermolecular interaction, the structure, and the orientation against the gold surface. However, the evidence for guest selectivity emerges primarily in the intensity of the spectra, rather than band positions or spectral patterns in the IR spectra.

  ROYAL SOC CHEMISTRY, 2015年, NEW JOURNAL OF CHEMISTRY, 39(11) (11), 8673 - 8680, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Formation of host-guest complexes on gold surface investigated by surface-enhanced IR absorption spectroscopy

  Yoshiya Inokuchi, Takahiro Mizuuchi, Takayuki Ebata, Toshiaki Ikeda, Takeharu Haino, Tetsunari Kimura, Hao Guo, Yuji Furutani

  We apply surface-enhanced infrared absorption (SEIRA) spectroscopy to host-guest complexes in liquid phase to examine the structural change in the complex formation. Two thiol derivatives of 18-crown-6 (18C6) are chemisorbed on a gold surface, and aqueous solutions of MCl salts (M = Li, Na, K, Rb, and Cs) are put to form M+·18C6 complexes. Infrared spectra of these complexes in the 900-2000 cm-1 region are obtained by SEIRA spectroscopy. The observed IR spectra show noticeable peaks due to the complex formation, demonstrating that SEIRA spectroscopy will be a powerful method to investigate the structure of host-guest complexes in supramolecular chemistry. © 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

  2014年01月, Chemical Physics Letters, 592, 90 - 95, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• 3P092 一酸化窒素還元酵素における基質NO結合の分子機構(02. ヘム蛋白質,ポスター,第52回日本生物物理学会年会(2014年度))

  Ishii Shoko, Kimura Tetsunari, Tosha Takehiko, Shiro Yoshitsugu, Kubo Minoru

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2014年, 生物物理, 54(1) (1), S264, 英語


• 2P092 過渡吸収分光法による一酸化窒素還元酵素の単寿命NO結合体の解析(02. ヘム蛋白質,ポスター,第52回日本生物物理学会年会(2014年度))

  Kimura Tetsunari, Ishii Shoko, Tosha Takehiko, Shiro Yoshitsugu, Kubo Minoru

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2014年, 生物物理, 54(1) (1), S210, 英語


• Distortion of the amide-I and -II bands of an α-helical membrane protein, pharaonis halorhodopsin, depends on thickness of gold films utilized for surface-enhanced infrared absorption spectroscopy

  Guo H, Kimura T, Furutani Y

  Surface-enhanced infrared absorption with attenuated total reflection (ATR-SEIRA) is a powerful tool for exploring molecular mechanisms of membrane proteins at the monolayer level. However, the band intensity, position, and direction can be largely influenced by the presence of a thin gold film, as observed for small molecules existing in close proximity to the surface. Here we investigated influence on the band shapes of an a-helical membrane protein, pharaonis halorhodopsin (pHR), attached on the gold surface through a complex formation between a six-histidines tag and a Ni-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) linker. Normal, bipolar, and inverted shapes of amide-I and -II bands were observed with an increase in film thickness, although pHR molecules would locate relatively far from the surface. The physical origin of this interesting phenomenon has been identified by changing incident angle, polarization, and film deposition rate. We find that the observed absorption anomalies are due to the influence of perpendicularly polarized light. Furthermore, it is shown that the band shapes are normal below the percolation threshold, and bipolar ones occur when an anomalous absorption by the films is strong, while the inverted ones develop with films in which surface scattering is predominant. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

  Elsevier B.V., 2013年06月, Chemical Physics, 419, 8 - 16, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• 1P241 赤外分光法によるチャネルロドプシンとキメラチャネルロドプシンの比較解析(18A. 光生物:視覚・光受容,ポスター,日本生物物理学会年会第51回(2013年度))

  Inaguma Asumi, Tsukamoto Hisao, Kimura Tetsunari, Ishizuka Toru, Yawo Hiromu, Furutani Yuji

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2013年, 生物物理, 53(1) (1), S145, 英語


• 1P097 酵素反応の時間分解分光解析を実現するマイクロ流路フローフラッシュ法の開発(02.ヘム蛋白質,ポスター,日本生物物理学会年会第51回(2013年度))

  Kimura Tetsunari, Tosha Takehiko, Shiro Yoshitsugu, Kubo Minoru

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2013年, 生物物理, 53(1) (1), S122, 英語


• 1P221 急速緩衝液交換法による時間分解全反射赤外分光法の開発(13C. 生体膜・人工膜:興奮・チャンネル,ポスター,日本生物物理学会年会第51回(2013年度))

  Furutani Yuji, Kimura Tetsunari, Okamoto Kido

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2013年, 生物物理, 53(1) (1), S142, 英語


• Development of a rapid Buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy with the step-scan mode

  Yuji Furutani, Tetsunari Kimura, Kido Okamoto

  Attenuated total reflectance (ATR)-FTIR spectroscopy has been widely used to probe protein structural changes under various stimuli, such as light absorption, voltage change, and ligand binding, in aqueous conditions. Timeresolved measurements require a trigger, which can be controlled electronically therefore, light and voltage changes are suitable. Here we developed a novel, rapid buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy to monitor the ligand- or ion-binding reaction of a protein. By using the step-scan mode (time resolution 2.5ms), we confirmed the completion of the buffer-exchange reaction within ~25ms the process was monitored by the infrared absorption change of a nitrate band at 1,350 cm-1. We also demonstrated the anionbinding reaction of a membrane protein, Natronomonas pharaonis halorhodopsin (pHR), which binds a chloride ion in the initial anion-binding site near the retinal chromophore. The formation of chloride- or nitrate-bound pHR was confirmed by an increase of the retinal absorption band at 1,528 cm-1. It also should be noted that low sample consumption (~1 μg of protein) makes this new method a powerful technique to understand ligand-protein and ion-protein interactions, particularly for membrane proteins. ©2013 THE BIOPHYSICAL SOCIETY OF JAPAN.

  2013年, Biophysics (Japan), 9, 123 - 129, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Dynamics of Dangling Bonds of Water Molecules in pharaonis Halorhodopsin during Chloride Ion Transportation

  Yuji Furutani, Kuniyo Fujiwara, Tetsunari Kimura, Takashi Kikukawa, Makoto Demura, Hideki Kandori

  Ion transportation via the chloride ion pump protein pharaonis halorhodopsin (pHR) occurs through the sequential formation of several intermediates during a photocyclic reaction. Although the structural details of each intermediate state have been studied, the role of water molecules in the translocation of chloride ions inside of the protein at physiological temperatures remains unclear. To analyze the structural dynamics of water inside of the protein, we performed time-resolved Fourier transform infrared (FUR) spectroscopy under H2O or (H2O)-O-18 hydration and successfully assigned water O-H stretching bands. We found that a dangling water band at 3626 cm(-1) in pHR disappears in the L-1 and L-2 states. On the other hand, relatively intense positive bands at 3605 and 3608 cm(-1) emerged upon the formation of the X(N) and O states, respectively, suggesting that the chloride transportation is accompanied by dynamic rearrangement of the hydrogen-bonding network of the internal water molecules in pHR

  AMER CHEMICAL SOC, 2012年10月, JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY LETTERS, 3(20) (20), 2964 - 2969, 英語

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  研究論文（学術雑誌）


• 1C1558 低収量生体分子の時間分解分光計測を目指した新規溶液交換・混合装置の開発(蛋白質-計測,解析,エンジニアリング,口頭発表,日本生物物理学会第50回年会(2012年度))

  Kimura Tetsunari, Furutani Yuji

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2012年, 生物物理, 52, S24, 英語


• 2PT182 時間分解赤外分光法によるファラオニスハロロドプシンの機能発現過程での水の水素結合ダイナミクス(日本生物物理学会第50回年会(2012年度))

  Fujiwara Kuniyo, Kimura Tetsunari, Kikukawa Takashi, Demura Makoto, Kandori Hideki, Furutani Yuji

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2012年, 生物物理, 52, S136 - S137, 英語


• 2PT183 全反射赤外分光法によるキメラチャネルロドプシンの構造変化解析(日本生物物理学会第50回年会(2012年度))

  Inaguma Asumi, Tsukamoto Hisao, Kimura Tetsunari, Ishizuka Toru, Yawo Hiromu, Furutani Yuji

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2012年, 生物物理, 52, S137, 英語


• Direct visualization reveals dynamics of a transient intermediate during protein assembly

  Xin Zhang, Vinh Q. Lam, Yun Mou, Tetsunari Kimura, Jaeyoon Chung, Sowmya Chandrasekar, Jay R. Winkler, Stephen L. Mayo, Shu-ou Shan

  Interactions between proteins underlie numerous biological functions. Theoretical work suggests that protein interactions initiate with formation of transient intermediates that subsequently relax to specific, stable complexes. However, the nature and roles of these transient intermediates have remained elusive. Here, we characterized the global structure, dynamics, and stability of a transient, on-pathway intermediate during complex assembly between the Signal Recognition Particle (SRP) and its receptor. We show that this intermediate has overlapping but distinct interaction interfaces from that of the final complex, and it is stabilized by long-range electrostatic interactions. A wide distribution of conformations is explored by the intermediate; this distribution becomes more restricted in the final complex and is further regulated by the cargo of SRP. These results suggest a funnel-shaped energy landscape for protein interactions, and they provide a framework for understanding the role of transient intermediates in protein assembly and biological regulation.

  NATL ACAD SCIENCES, 2011年04月, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 108(16) (16), 6450 - 6455, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Time-resolved small-angle X-ray scattering study of the folding dynamics of barnase

  Tsuyoshi Konuma, Tetsunari Kimura, Shuzo Matsumoto, Yuji Goto, Tetsuro Fujisawa, Alan R. Fersht, Satoshi Takahashi

  Structural changes of barnase during folding were investigated using time-resolved small-angle X-ray scattering (SAXS). The folding of barnase involves a burst-phase intermediate, sometimes designated as the denatured state under physiological conditions, Dphys, and a second hidden intermediate. Equilibrium SAXS measurements showed that the radius of gyration (Rg) of the guanidine unfolded state (U) is 26.9 ± 0.7 Å, which remains largely constant over a wide denaturant concentration range. Time-resolved SAXS measurements showed that the Rg value extrapolated from kinetic Rg data to time zero, Rg,0, is 24.3 ± 0.1 Å, which is smaller than that of U but which is expanded from that of folding intermediates of other proteins with similar chain lengths (19 Å). After the burst-phase change, a single-exponential reduction in Rg2 was observed, which corresponds to the formation of the native state for the major component containing the native trans proline isomer. We estimated Rg of the minor component of Dphys containing the non-native cis proline isomer (Dphys,cis) to be 25.7 ± 0.6 Å. Moreover, Rg of the major component of D phys containing the native proline isomer (Dphys,tra) was estimated as 23.9 ± 0.2 Å based on Rg,0. Consequently, both components of the burst-phase intermediate of barnase (Dphys,tra and Dphys,cis) are still largely expanded. It was inferred that Dphys possesses the N-terminal helix and the center of the β-sheet formed independently and that the formation of the remainder of the protein occurs in the slower phase. © 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

  2011年02月, Journal of Molecular Biology, 405(5) (5), 1284 - 1294, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• 2SH-02 急速溶液混合全反射赤外分光法によるイオン輸送蛋白質の構造変化ダイナミクス計測への挑戦(2SH 膜タンパク質の構造変化を研究するための新しい実験ツール,日本生物物理学会第49回年会(2011年度))

  古谷 祐詞, Kimura Tetsunari

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2011年, 生物物理, 51, S20, 英語


• 2Q1624 KcsAと微生物型ロドプシンの融合タンパク質の調製と分析(光生物_視覚・光受容2,第49回日本生物物理学会年会)

  Muramatsu Chikako, Kawanabe Akira, Kimura Tetsunari, Kandori Hideki, Furutani Yuji

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2011年, 生物物理, 51, S103, 英語


• 3B1024 全反射赤外分光法によるMg^<2+>輸送体MgtEのイオン選択機構の解析(3B 膜蛋白質2,日本生物物理学会第49回年会)

  Kimura Tetsunari, Douki Shintaro, Ishitani Ryuichiro, Nureki Osamu, Furutani Yuji

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2011年, 生物物理, 51, S109, 英語


• 3A1546 SEIRA spectroscopy of a halorhodopsin monolayer on gold island film(3A Biol & Artifi memb 4: Transport, Signal transduction,The 49th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan)

  Guo Hao, Kimura Tetsunari, Furutani Yuji

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2011年, 生物物理, 51, S108, 英語


• 2P031 1G1505 時間分解FTIRスペクトル計測によるファラオニスハロロドプシンの塩化物イオン輸送過程での構造変化解析(蛋白質-構造機能相関,第48回日本生物物理学会年会)

  Kimura Tetsunari, Kandori Hideki, Furutani Yuji

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2010年, 生物物理, 50(2) (2), S87, 英語


• 2SC1350 マイクロ-ミリ秒時間領域における蛋白質のフォールディングダイナミクス(2SC 蛋白質の動態解析の最前線-in silico, in vitro and in vivo,第48回日本生物物理学会年会)

  木村 哲就

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2010年, 生物物理, 50(2) (2), S11, 英語


• Dehydration of main-chain amides in the final folding step of single-chain monellin revealed by time-resolved infrared spectroscopy

  Tetsunari Kimura, Akio Maeda, Shingo Nishiguchi, Koichiro Ishimori, Isao Morishima, Takashi Konno, Yuji Goto, Satoshi Takahashi

  Kinetic IR spectroscopy was used to reveal beta-sheet formation and water expulsion in the folding of single-chain monellin (SMN) composed of a five-stranded beta-sheet and an alpha-helix. The time-resolved IR spectra between 100 mu s and 10 s were analyzed based on two consecutive intermediates, I(1) and I(2), appearing within 100 mu s and with a time constant of approximate to 100 ms, respectively. The initial unfolded state showed broad amide I' corresponded to a fluctuating conformation. In contrast, I(1) possessed a feature at 1,636 cm(-1) for solvated helix and weak features assignable to turns, demonstrating the rapid formation of helix and turns. I(2) possessed a line for solvated helix at 1,637 cm(-1) and major and minor lines for beta-sheet at 1,625 and 1,680 cm(-1), respectively. The splitting of the major and minor lines is smaller than that of the native state, implying an incomplete formation of the beta-sheet. Furthermore, both major and minor lines demonstrated a low-frequency shift compared to those of the native state, which was interpreted to be caused by hydration of the C=O group in the beta-sheet. Together with the identification of solvated helix, the core domain of I(2) was interpreted as being hydrated. Finally, slow conversion of the water-penetrated core of I(2) to the dehydrated core of the native state was observed. We propose that both the expulsion of water, hydrogen-bonded to main-chain amides, and the completion of the secondary structure formation contribute to the energetic barrier of the rate-limiting step in SMN folding.

  NATL ACAD SCIENCES, 2008年09月, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 105(36) (36), 13391 - 13396, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• 2P078 時分割X線小角散乱法によるバルナーゼの折り畳み中間体の研究(蛋白質(物性(安定性、折れ畳みなど)),ポスター発表,第45回日本生物物理学会年会)

  小沼 剛, 木村 哲就, 松本 周三, 後藤 祐児, 藤澤 哲郎, 高橋 聡

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2007年, 生物物理, 47, S132, 英語


• Site-specific collapse dynamics guide the formation of the cytochrome c ' four-helix bundle

  Tetsunari Kimura, Jennifer C. Lee, Harry B. Gray, Jay R. Winkler

  The evolution of tryptophan-to-heme (W/heme) distance distributions extracted from analysis of fluorescence energy transfer kinetics during the refolding of Rhodopseudomonas palustris cytochrome c' reveals dramatic differences between two variants [W32 (Q1A/F32W1W72F) and W72 (Q1A)]. Both W32/heme and W72/heme distance distributions measured at the earliest time point attainable with a continuous-flow mixer (150 mu s) confirm that the polypeptide ensemble is not uniformly collapsed and that native structure is not formed. Time-resolved fluorescence spectra indicate that W32 is sequestered from the aqueous solution during the first 700 mu s of folding, whereas W72 remains exposed to solvent. The first moment of the W32/heme distance distribution evolves to its native value faster than that of W72, suggesting that the approach of W32 to the heme precedes that of W72.

  NATL ACAD SCIENCES, 2007年01月, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 104(1) (1), 117 - 122, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Time-resolved small-angle X-ray scattering investigation of the folding dynamics of heme oxygenase: Implication of the scaling relationship for the submillisecond intermediates of protein folding

  T Uzawa, T Kimura, K Ishimori, Morishima, I, T Matsui, M Ikeda-Saito, S Takahashi, S Akiyama, T Fujisawa

  Polypeptide collapse is generally observed as the initial folding dynamics of proteins with more than 100 residues, and is suggested to be caused by the coil-globule transition explained by Flory's theory of polymers. To support the suggestion by establishing a scaling behavior between radius of gyration (R-g) and chain length for the initial folding intermediates, the folding dynamics of heme oxygenase (HO) was characterized by time-resolved, small-angle X-ray scattering. HO is a highly helical protein without disulfide bridges, and is the largest protein (263 residues) characterized by the method. The folding process of HO was found to contain a transient oligomerization; however, the conformation within 10 ms was demonstrated to be monomeric and to possess R-g of 26.1(+/- 1.1) angstrom. Together with the corresponding data for proteins with different chain lengths, the seven R-g values demonstrated the scaling relationship to chain length with a scaling exponent of 0.35 +/- 0.11, which is close to the theoretical value of 1/3 predicted for globules in solutions where monomer-monomer interactions are favored over monomer-solvent interactions (poor solvent). The finding indicated that the initial folding dynamics of proteins bears the signature of the coil-globule transition, and offers a clue to explain the folding mechanisms of proteins with different chain lengths. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

  ACADEMIC PRESS LTD- ELSEVIER SCIENCE LTD, 2006年03月, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, 357(3) (3), 997 - 1008, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• S3f1-4 Generality of Initial Collapse Demonstrated by Scaling Relationship for Submillisecond Intermediates of Protein Folding(S3-f1: "Hydration Effects on Structure and Thermodynamics of Proteins,Symposia,Abstract,Meeting Program of EABS & BSJ 2006)

  Uzawa Takanori, Kimura Tetsunari, Ishimori Koichiro, Morishima Isao, Matsui Toshitaka, Ikeda-Saito Masao, Takahashi Satoshi, Akiyama Shuji, Fujisawa Tetsuro

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2006年, 生物物理, 46(2) (2), S139, 英語


• Dehydration in the folding of reduced cytochrome c revealed by the electron-transfer-triggered folding under high pressure

  T Kimura, K Sakamoto, Morishima, I, K Ishimori

  AMER CHEMICAL SOC, 2006年01月, JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 128(3) (3), 670 - 671, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Specifically collapsed intermediate in the early stage of the folding of ribonuclease A

  Tetsunari Kimura, Shuji Akiyama, Takanori Uzawa, Koichiro Ishimori, Isao Morishima, Tetsuro Fujisawa, Satoshi Takahashi

  Nature of the burst-phase signals of protein folding has been the subject of much debate as to whether the signals represent the formation of early intermediates or the non-specific collapse of unfolded polypeptides. To distinguish the two possibilities, the submillisecond folding dynamics of ribonuclease A (RNase A) was examined, and compared with those of the disulfide bond-ruptured analog of RNase A (r-RNase A). The circular dichroism measurements on RNase A showed the burst-phase signal within 320 μs after the initiation of the folding reaction, which was identical to that observed for r-RNase A. In contrast, the burst phase increase in the extrinsic fluorescence from 1-anilino-8-naphthalene sulfonate (ANS) was observed for RNase A but not for r-RNase A. The kinetic titration experiment of the ANS fluorescence intensity showed the presence of a specific binding site for ANS in the fast-refolding component of RNase A. The small-angle X-ray scattering measurements at ∼22 ms after initiating the folding reaction demonstrated that the burst phase conformations of the medium and slow-refolding components of RNase A were distinctly smaller than that of r-RNase A. These results indicated the difference in the burst phase conformations of RNase A and r-RNase A. Since r-RNase A is denatured in the physiological solution condition, the burst-phase signal of RNase A was interpreted as the formation of the folding intermediate with specific conformations. © 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

  2005年07月, Journal of Molecular Biology, 350(2) (2), 349 - 362, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Specific collapsed followed by slow hydrogen-bond formation of β-sheet in the folding of single-chain monellin

  Tetsunari Kimura, Takanori Uzawa, Koichiro Ishimori, Isao Morishima, Satoshi Takahashi, Takashi Konno, Shuji Akiyama, Tetsuro Fujisawa

  Characterization of the conformational landscapes for proteins with different secondary structures is important in elucidating the mechanism of protein folding. The folding trajectory of single-chain monellin composed of a five-stranded β-sheet and a helix was investigated by using a pH-jump from the alkaline unfolded to native state. The kinetic changes in the secondary structures and in the overall size and shape were measured by circular dichroism spectroscopy and small-angle x-ray scattering, respectively. The formation of the tertiary structure was monitored by intrinsic and extrinsic fluorescence. A significant collapse was observed within 300 μs after the pH-jump, leading to the intermediate with a small amount of secondary and tertiary structures but with an overall oblate shape. Subsequently, the stepwise formation of secondary and tertiary structures was detected. The current observation was consistent with the theoretical prediction that a more significant collapse precedes the formation of secondary structures in the folding β-sheet proteins than that of helical proteins [Shea, J. E., Onuchic, J. N. & Brooks, C. L., III (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16064-16068]. Furthermore, it was implied that the initial collapse was promoted by the formation of some specific structural elements, such as tight turns, to form the oblate shape. © 2005 by The National Academy of Science of the USA.

  2005年02月, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(8) (8), 2748 - 2753, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of α-helical content and compactness

  Takanori Uzawa, Shuji Akiyama, Tetsunari Kimura, Satoshi Takahashi, Koichiro Ishimori, Isao Morishima, Tetsuro Fujisawa

  The characterization of protein folding dynamics in terms of secondary and tertiary structures is important in elucidating the features of intraprotein interactions that lead to specific folded structures. Apomyoglobin (apoMb), possessing seven helices termed A-E, G, and H in the native state, has a folding intermediate composed of the A, G, and H helices, whose formation in the submillisecond time domain has not been clearly characterized. In this study, we used a rapid-mixing device combined with circular dichroism and small-angle x-ray scattering to observe the submillisecond folding dynamics of apoMb in terms of helical content (fH) and radius of gyration (R g), respectively. The folding of apoMb from the acid-unfolded state at pH 2.2 was initiated by a pH jump to 6.0. A significant collapse, corresponding to ≈50% of the overall change in Rg from the unfolded to native conformation, was observed within 300μs after the pH jump. The collapsed intermediate has a fH of 33% and a globular shape that involves > 80% of all its atoms. Subsequently, a stepwise helix formation was detected, which was interpreted to be associated with a conformational search for the correct tertiary contacts. The characterized folding dynamics of apoMb indicates the importance of the initial collapse event, which is suggested to facilitate the subsequent conformational search and the helix formation leading to the native structure.

  2004年02月, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(5) (5), 1171 - 1176, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• 3P023 ヘムオキシゲナーゼの折れ畳みにみるオリゴマー形成と初期収縮の意義(蛋白質 C) 物性 : 安定性、折れたたみなど)

  鵜澤 尊規, 木村 哲就, 高橋 聡, 石森 浩一郎, 秋山 修志, 藤澤 哲郎, 松井 敏高, 齋藤 正男

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2004年, 生物物理, 44, S195, 日本語


• 3P017 高圧を利用した還元型シトクロムcの折り畳み機構における水分子の寄与の解明(蛋白質 C) 物性 : 安定性、折れたたみなど)

  木村 哲就, 関山 直孝, 坂本 光一, 森島 績, 石森 浩一郎

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2004年, 生物物理, 44, S194, 日本語


• アポミオグロビンの折れ畳み過程における主鎖の収縮と三次構造の構築

  鵜澤 尊規, 木村 哲就, 高橋 聡, 石森 浩一郎, 森島 績, 秋山 修志, 藤澤 哲郎

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2003年, 生物物理, 43, S60, 日本語


• コイルドコイルGCN4-p1'の折り畳み過程における揺らぎ領域の役割

  木下 雅仁, 木村 哲就, 高橋 聡, 石森 浩一郎, 森島 績

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2003年, 生物物理, 43, S61, 日本語


• 一本鎖モネリンの折り畳み機構に関する研究 : 二次構造形成過程と疎水性残基パッキング過程の追跡

  木村 哲就, 高橋 聡, 今野 卓, 石森 浩一郎, 森島 績

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2003年, 生物物理, 43, S59, 日本語


• Conformational landscape of cytochrome c folding studied by microsecond-resolved small-angle x-ray scattering

  Shuji Akiyama, Satoshi Takahashi, Tetsunari Kimura, Koichiro Ishimori, Isao Morishima, Yukihiro Nishikawa, Tetsuro Fujisawa

  To investigate protein folding dynamics in terms of compactness, we developed a continuous-flow mixing device to make smallangle x-ray scattering measurements with the time resolution of 160 μs and characterized the radius of gyration (Rg) of two folding intermediates of cytochrome c (cyt c). The early intermediate possesses ≈-20 Å of Rg, which is smaller by ≈-4 A than that of the acid-unfolded state. The Rg of the later intermediate is ≈-18 Å, which is close to that of the molten globule state. Considering the α-helix content (fH) of the intermediates, we clarified the folding pathway of cyt c on the conformational landscape defined by Rg and fH- Cyt c folding proceeds with a collapse around a specific region of the protein followed by a cooperative acquisition of secondary structures and compactness.

  2002年02月, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99(3) (3), 1329 - 1334, 英語

  [査読有り]

  研究論文（学術雑誌）


• 3M1030 マイクロ秒分割FTIR分光法による一本鎖モネリンの折り畳み過程の観測(1.蛋白質(C)物性,一般講演,日本生物物理学会第40回年会)

  木村 哲就, 高橋 聡, 今野 卓, 石森 浩一郎, 森島 績

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2002年, 生物物理, 42(2) (2), S190, 日本語


• 3P029サブミリ秒X線小角散乱測定を用いたアポミオグロビンの折れ畳み過程の研究

  鵜澤 尊規, 秋山 修志, 木村 哲就, 高橋 聡, 石森 浩一郎, 森島 績, 西川 幸宏, 藤沢 哲郎

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2001年, 生物物理, 41, S166, 日本語


• 3A0930 高速液体混合装置を用いたリボヌクレアーゼA折れ畳み初期過程の研究

  木村 哲就, 秋山 修志, 高橋 聡, 原田 最之, 石森 浩一郎, 森島 績

  一般社団法人 日本生物物理学会, 2000年, 生物物理, 40, S161, 日本語

• ドデシル硫酸ナトリウム共存下でのαシヌクレイン凝集反応の多様性

  北野さくら, 柚佳祐, 笹田航, 木村哲就, 茶谷絵理

  2023年, 日本蛋白質科学会年会プログラム・要旨集, 23rd (CD-ROM)


• 鉄還元機能を持つ6回膜貫通型タンパク質101F6の大腸菌での発現と機能解析

  阪口智哉, 澤井仁美, 城宜嗣, 鍔木基成, 當舎武彦, 木村哲就, 杉本宏

  2023年, 日本生化学会大会(Web), 96th


• 二液混合シリアルフェムト秒結晶構造解析による酵素反応追跡

  南後恵理子, 南後恵理子, LUO Fangjia, LUO Fangjia, 木村哲就, 菅原道泰, 中根崇智, 鈴木守, 桝田哲哉, 溝端栄一, 登野健介, 登野健介, 岩田想, 岩田想

  2021年, 日本結晶学会年会講演要旨集, 2021


• Molecular Mechanism of the Catalytic Reaction of no Reductase Revealed by Novel Time-Resolved Visible/IR Absorption Spectrometers with Microfluidic Device

  Tetsunari Kimura, Hanae Takeda, Shoko Ishii, Takehiko Tosha, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo

  CELL PRESS, 2016年02月, BIOPHYSICAL JOURNAL, 110(3) (3), 548A - 548A, 英語

  研究発表ペーパー・要旨（国際会議）


• SACLAにおけるシリアルフェムト秒X線結晶構造解析の技術開発

  田中智之, 菅原道泰, 中根崇智, 木村哲就, 木村哲就, 久保稔, 久保稔, 宮島謙, 宮島謙, 登野健介, 真船文隆, 真船文隆, 南後恵理子, 南後恵理子, 岩田想, 岩田想

  2016年, 日本結晶学会年会講演要旨集, 2016


• 時分割シリアルフェムト秒X線結晶解析法によるバクテリオロドプシン光反応中間体の構造解析

  南後恵理子, NEUTZE Richard, 久保稔, 久保稔, 木村哲就, 中根崇智, ROYANT Antoine, 登野健介, 岩田想

  2015年, 日本結晶学会年会講演要旨集, 2015


• 急速緩衝液交換法による時間分解全反射赤外分光法の開発

  古谷 祐詞, 木村 哲就, 岡本 基土

  日本生物物理学会, 2014年09月30日, 生物物理, 54(5) (5), 272 - 275, 日本語

  [査読有り][招待有り]

  記事・総説・解説・論説等（学術雑誌）


• C-2 霊長類、視覚・味覚のGPCR型受容体に対する赤外分光研究

  神取 秀樹, 片山 耕大, 古谷 祐詞, 木村 哲就

  京都大学霊長類研究所, 2012年10月04日, 霊長類研究所年報, 42, 118 - 118, 日本語


• Conformational changes upon chloride-ion pumping during the pharaonis halorhodopsin photocycle studied by time-resolved FTIR difference spectroscopy

  Tetsunari Kimura, Hideki Kandori, Yuji Furutani

  AMER CHEMICAL SOC, 2011年03月, ABSTRACTS OF PAPERS OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 241, 英語

  研究発表ペーパー・要旨（国際会議）


• PHYS 341-Folding dynamics of acyl-CoA binding protein probed by energy-transfer kinetics measurements

  Tetsunari Kimura, Harry B. Gray, Jay R. Winkler

  AMER CHEMICAL SOC, 2008年08月, ABSTRACTS OF PAPERS OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 236, 英語

  研究発表ペーパー・要旨（国際会議）


• Direct observation of the multistep helix formation of poly-L-glutamic acids using microsecond-resolved FTIR and CD spectroscopies.

  T Kimura, S Takahashi, S Akiyama, T Uzawa, K Ishimori, Morishima, I

  BIOPHYSICAL SOCIETY, 2003年02月, BIOPHYSICAL JOURNAL, 84(2) (2), 162A - 162A, 英語

  研究発表ペーパー・要旨（国際会議）


• Direct observation of the multistep helix formation of poly-L-glutamic acids

  T Kimura, S Takahashi, S Akiyama, T Uzawa, K Ishimori, Morishima, I

  AMER CHEMICAL SOC, 2002年10月, JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 124(39) (39), 11596 - 11597, 英語

• ヘムタンパク質の科学 : 生理機能の理解とその展開に向けて

  城, 宜嗣, 青野, 重利, 齋藤, 正男

  分担執筆, 第１編 第５章 第５節 反応速度論, エヌ・ティー・エス, 2022年05月, 日本語, ISBN: 9784860437787

• Spectroscopic analysis of BhuUV-T reconstituted with amphiphilic polymers

  Yuki Sumida, Ayaka Naka, Yasuhiro Kobori, Yoshitsugu Shiro, Hiroshi Sugimoto, Tetsunari Kimura

  第61回日本生物物理学会年会, 2023年11月, 英語, 名古屋国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• 蛍光タンパク質イクオリンとカルシウムの結合に関する熱力学的解析

  黒木麗, 大崎優香, 船橋俊也, 中津亨, 木村哲就

  第96回日本生化学会大会, 2023年11月, 日本語, 福岡国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• 分光学的手法を用いたABCトランスポーター BhuUV-Tにおけるヘム輸送の機構解明

  原明穂, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第96回日本生化学会大会, 2023年11月, 日本語, 福岡国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• 鉄還元機能を持つ6回膜貫通型タンパク質101F6の大腸菌での発現と機能解析

  阪口 智哉, 澤井 仁美, 城 宜嗣, 鍔木 基成, 當舎 武彦, 木村 哲就, 杉本 宏

  第96回日本生化学会大会, 2023年11月, 日本語, 福岡国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• Development of microfluidic mixers for time-resolved SFX and spectroscopy and their applications

  Tetsunari KIMURA

  UK/Japan meeting and workshop “Dynamic Crystallography-XFELs and Synchrotrons to study enzyme reactions”, 2023年09月, 英語, University of Lancaster, 国際会議

  [招待有り]

  口頭発表（一般）


• Time-resolved Measurements for Structural and Functional Dynamics of Membrane Protein Complexes

  Tetsunari Kimura, Ayaka Naka, Akiho Hara, Yoshitsugu Shiro, Hiroshi Sugimoto

  9IDMRCS, 2023年08月, 英語, 幕張メッセ国際会議場, 国際会議

  [招待有り]

  口頭発表（一般）


• イクオリンのCa2+結合によって誘起される化学発光反応に関する熱力学・速度論的解析

  黒木麗, 大崎優香, 船橋俊也, 中津亨, 木村哲就

  第23回日本蛋白質科学会年会, 2023年07月, 英語, 名古屋国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• ABCトランスポーターBhuUV-Tにおけるヘム輸送の時間分解分光測定

  原明穂, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第23回日本蛋白質科学会年会, 2023年07月, 英語, 名古屋国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• 物理化学的解析による発光タンパク質イクオリンの反応機構

  木村哲就, 大崎優香, 黒木麗, 船橋俊也, 中津亨

  新学術領域研究「高速分子動画」領域セミナー, 2023年05月, 英語, 理研・横浜, 国内会議

  ポスター発表


• 時間分解分光測定によるタンパク質の機能・構造解析

  木村哲就

  東北大学多元研セミナー, 2023年02月, 日本語, 東北大多元研, 東北大多元研, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（一般）


• 物理化学的解析による発光タンパク質イクオリンの反応機構

  木村哲就, 大崎優香, 黒木麗, 船橋俊也, 中津亨

  新学術領域研究「高速分子動画」領域会議, 2022年11月, 日本語, MEXT Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area ”Non-equilibrium-state molecular movies and their applications (Molecular Movies)", 淡路夢舞台, 国内会議

  ポスター発表


• Development and application of complementary spectroscopic methods for dynamic structural biology

  Tetsunari KIMURA

  IPR seminar, 2022年10月, 英語, "Cooperation: RIKEN Pioneering Project ""Biology of Intracellular Environments"" MEXT Program for Promoting Researches on the Supercomputer Fugaku ""Biomolecular dynamics in a living cell"" MEXT Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) ""New Cross Scale Biology"" MEXT Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area ”Non-equilibrium-state molecular movies and their applications (Molecular Movies)", 阪大蛋白質研究所, 国際会議

  [招待有り]

  口頭発表（一般）


• 蛍光タンパク質イクオリンとカルシウムの結合に関する熱力学的解析

  黒木麗, 船橋俊也, 大西裕介, 中津亨, 木村哲就

  第60回日本生物物理学会年会, 2022年09月, 英語, 函館アリーナ・函館市民会館, 国内会議

  ポスター発表


• 二重スピンラベル-ESR分光法によるABCトランスポーターの膜貫通ドメインのコンフォメーション変化

  仲絢香, 小堀 康博, 鍔木 基成, 城 宜嗣, 杉本 宏, 木村哲就

  第60回日本生物物理学会年会, 2022年09月, 英語, 函館アリーナ・函館市民会館, 国内会議

  ポスター発表


• 時間分解分光測定を用いたABCトランスポーターBhuUV-Tにおけるヘム輸送機構の解析

  原明穂, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第60回日本生物物理学会年会, 2022年09月, 英語, 函館アリーナ・函館市民会館, 国内会議

  ポスター発表


• ナノディスクに再構成した鉄還元膜タンパク質CYB561D2 によって誘起される脂質過酸化の解析

  山口葵, 鍔木 基成, 木村 哲就

  第60回日本生物物理学会年会, 2022年09月, 英語, 函館アリーナ・函館市民会館, 国内会議

  ポスター発表


• ITCを用いたイクオリンCa2+間相互作用の熱力学的解析

  黒木麗, 船橋俊也, 大西裕介, 中津亨, 木村哲就

  第48回生体分子科学討論会, 2022年06月, 日本語, とりぎん文化会館小ホール, 国内会議

  ポスター発表


• 101F6ナノディスクによる電子移動反応の実験的解析

  山口葵, 鍔木 基成, 木村 哲就

  第48回生体分子科学討論会, 2022年06月, 日本語, とりぎん文化会館小ホール, 国内会議

  ポスター発表


• 二重スピンラベル-ESR分光法を用いた ABCトランスポーターBhuUV-Tの構造解析

  仲絢香, 小堀 康博, 鍔木 基成, 城 宜嗣, 杉本 宏, 木村哲就

  第48回生体分子討論会, 2022年06月, 日本語, とりぎん文化会館小ホール, 国内会議

  ポスター発表


• ABCトランスポーターBhuUV-Tにおけるヘム輸送機構の分光学的解析

  原明穂, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第48回生体分子科学討論会, 2022年06月, 日本語, とりぎん文化会館小ホール, 国内会議

  ポスター発表


• ヘムABCトランスポーター; BhuUV-T の膜輸送に関するキネティクス解析

  木村哲就

  第22回日本蛋白質科学会年会, 2022年06月, 英語, つくば国際会議場, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（一般）


• イクオリン -Ca2+ 間相互作用の熱力学的解析

  黒木麗, 船橋俊也, 大西裕介, 中津亨, 木村哲就

  第22回日本蛋白質科学会年会, 2022年06月, 英語, つくば国際会議場, 国内会議

  口頭発表（一般）


• 鉄還元膜タンパク質101F6-ナノディスクにおける電子移動反応の分光分析

  山口葵, 鍔木 基成, 木村 哲就

  第22回蛋白質科学会年会, 2022年06月, 英語, つくば国際会議場, 国内会議

  口頭発表（一般）


• 二重スピンラベルESR分光法を用いたABCトランスポーターBhuUV-TのATP結合状態の解析

  仲絢香, 小堀 康博, 鍔木 基成, 城 宜嗣, 杉本 宏, 木村哲就

  第22回日本蛋白質科学会, 2022年06月, 英語, つくば国際会議場, 国内会議

  口頭発表（一般）


• ABCトランスポーターBhuUV-Tのヘム輸送機構に関する時間分解分光測定

  原明穂, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第22回日本蛋白質科学会年会, 2022年06月, 英語, つくば国際会議場, 国内会議

  口頭発表（一般）


• Microspectroscopic systemsfor time-resolved measurementsof protein microcrystals

  木村哲就

  新学術領域研究「高速分子動画」領域会議, 2022年05月, 日本語, 日本蛋白質科学会, 理研・横浜, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（一般）


• マイクロ流路デバイスを用いた時間分解顕微分光法による膜輸送の分子機構解析

  木村 哲就

  神戸大学先端融合研究環開拓プロジェクトシンポジウム, 2022年03月, 日本語, Web上での発表, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• 膜輸送タンパク質 ABC トランスポーターの機能・構造変化の分光学的解析

  木村 哲就

  日本分光学会 関西支部令和３年度講演会, 2022年03月, 日本語, 日本分光学会 関西支部, Web上での発表, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• Structural changes of a-synuclein, an intrinsically disordered protein, along the lipid-binding and oligomerization revealed by fluorescence lifetime measurements

  Tetsunari Kimura

  PacifiChem2021, 2021年12月, 英語, Pacific Basin Chemical Societies, Web上での発表, 国際会議

  口頭発表（一般）


• Structural changes of a-synuclein, an intrinsically disordered protein, along the lipid-binding and oligomerization revealed by fluorescence lifetime measurements

  Ko Sasada, Tetsunari Kimura, Ryosuke Matsubara, Koichi Fujii

  PacifiChem2021, 2021年12月, 英語, Pacific Basin Chemical Societies, Web上での発表, 国際会議

  ポスター発表


• Structural changes of a-synuclein, an intrinsically disordered protein, along the lipid-binding and oligomerization revealed by fluorescence lifetime measurements

  Aoi Yamaguchi, Hamed A. Abosharaf, Motonari Tsubaki, Tetsunari Kimura

  PacifiChem2021, 2021年12月, 英語, Pacific Basin Chemical Societies, Web上での発表, 国際会議, 国際共著している

  ポスター発表


• ナノディスクに再構成した鉄還元膜タンパク質101F6における電子移動反応の解析

  山口葵, Abosharaf Hamed A., 鍔木基成, 木村哲就

  第59回日本生物物理学会年会, 2021年11月, 英語, Web上での発表, 国内会議, 国際共著している

  口頭発表（一般）


• CW-ESR分光法によるヌクレオチド結合型ABCトランスポーターの構造解析

  仲絢香, 小堀康博, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第59回日本生物物理学会年会, 2021年11月, 英語, Web上での発表, 国内会議

  口頭発表（一般）


• 蛍光寿命測定による脂質二重膜結合状態におけるα-Synucleinの立体構造解析

  笹田航, 松原亮介, 藤井宏一, 木村哲就

  第59回日本生物物理学会年会, 2021年11月, 英語, Web上での発表, 国内会議

  口頭発表（一般）


• 時間分解分光法を用いたヘムABCトランスポーターBhuUV-Tにおける輸送過程の速度論的解析

  木村 哲就

  第59回日本生物物理学会年会, 2021年11月, 英語, 日本生物物理学会, Web上での発表, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• ナノディスク再構成型鉄還元膜タンパク質101F6における電子移動反応の解析

  山口葵, Abosharaf Hamed A., 鍔木基成, 木村哲就

  第94回日本生化学大会, 2021年11月, 日本語, 日本生化学会, Web上での発表, 国内会議, 国際共著している

  ポスター発表


• Double spin-label ESR spectroscopic analysis of structural changes in heme ABC transporter induced by nucleotide-binding.

  仲絢香, 小堀康博, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第94回日本生化学大会, 2021年11月, 日本語, 日本生化学会, Web上での発表, 国内会議

  ポスター発表


• 蛍光寿命測定によるα-Synucleinの脂質二重膜結合状態の構造解析

  笹田航, 松原亮介, 藤井宏一, 木村哲就

  第21回日本蛋白質科学会年会, 2021年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, Web上での発表, 国内会議

  ポスター発表


• 二重スピンラベルESR分光法を用いたヘムインポーターBhuUV-Tの構造ダイナミクスの解析

  仲絢香, 小堀康博, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第21回日本蛋白質科学会年会, 2021年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, Web上での発表, 国内会議

  ポスター発表


• 101F6 ナノディスクを用いた電子移動反応の実験的解析

  山口葵, Abosharaf Hamed A., 鍔木基成, 木村哲就

  第21回日本蛋白質科学会年会, 2021年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, Web上での発表, 国内会議, 国際共著している

  ポスター発表


• ナノディスク再構成型BhuUV-Tによる段階的な基質輸送の分光学的観察

  木村哲就, 浅田拓也, 林沙英, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏

  第21回日本蛋白質科学会年会, 2021年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, Web上での発表, 国内会議

  ポスター発表


• ナノディスク再構成型BhuUV-Tによる段階的な基質輸送の分光学的観察

  木村哲就, 浅田拓也, 林沙英, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏

  第21回日本蛋白質科学会年会, 2021年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, Web上での発表, 国内会議

  口頭発表（一般）


• ヘムABCトランスポーターBhuUVの輸送機構に関する分光学的解析

  木村哲就, 浅田拓也, 仲絢香, 林沙英, 城宜嗣, 杉本宏

  第47回生体分子科学討論会, 2021年06月, 日本語, 第47回生体分子科学討論会実行委員会, Web上での発表, 国内会議

  口頭発表（一般）


• 101F6ナノディスクを用いた電子移動反応の実験的解析

  山口葵, Abosharaf Hamed A., 鍔木基成, 木村哲就

  第47回生体分子科学討論会, 2021年06月, 日本語, 第47回生体分子科学討論会実行委員会, Web上での発表, 国内会議, 国際共著している

  ポスター発表


• 二重スピンラベルESR分光法を用いたABCトランスポーターBhuUVの構造解析

  仲絢香, 小堀康博, 鍔木基成, 城宜嗣, 杉本宏, 木村哲就

  第47回生体分子科学討論会, 2021年06月, 日本語, 第47回生体分子科学討論会実行委員会, Web上での発表, 国内会議

  ポスター発表


• α-Synucleinの脂質二重膜結合状態の分光学的構造解析

  笹田航, 松原亮介, 藤井宏一, 木村哲就

  第47回生体分子科学討論会, 2021年06月, 日本語, 第47回生体分子科学討論会実行委員会, Web上での発表, 国内会議

  ポスター発表


• 分子拡散混合を利用したヘムABCトランスポーターの時間分解分光解析

  木村 哲就

  ピコバイオロジー研究会, 2020年12月, 日本語, 兵庫県立大ピコバイオロジー研究所, 上郡町, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• Structural and functional dynamics of ABC transporters clarified by novel time-resolved measurement systems

  木村 哲就

  International Conference on Chemical and Environmental Sciences 2020, 2020年12月, 英語, Institute of Engineering & Management, Kolkata, Web上での発表, 国際会議

  [招待有り]

  口頭発表（基調）


• Time-resolved spectroscopic measurements on the transport dynamics of ABC transporter

  木村 哲就, 林 沙英, 池本 夕佳, 城 宜嗣, 杉本 宏

  第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 英語, 日本生物物理学会, オンライン, 国内会議

  ポスター発表


• リン脂質二重膜ナノディスクへの再構成に伴うヒトSteap3の三価鉄還元酵素活性の増強

  西 綾音, 中田 壯人, 武内 総子, 木村 哲就, 鍔木 基成

  第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 英語, 日本生物物理学会, オンライン, 国内会議

  ポスター発表


• マイクロ秒時間領域で形成される一酸化窒素還元酵素反応中間体の分光解析

  當舎 武彦, 武田 英恵, 木村 哲就, 堀谷 正樹, 城 宜嗣

  第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 英語, 日本生物物理学会, オンライン, 国内会議

  ポスター発表


• ナノディスク再構成型ヘムABCトランスポーターを用いた基質輸送機構の分光学的解析

  浅田 拓也, 鍔木 基成, 城 宜嗣, 杉本 宏, 木村 哲就

  第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 英語, 日本生物物理学会, オンライン, 国内会議

  ポスター発表


• Structural changes of a-synuclein along the lipid-binding and oligomerization revealed by fluorescence lifetime measurements.

  笹田 航, 藤井 宏一, 松原 亮介, 木村 哲就

  第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 英語, 日本生物物理学会, オンライン, 国内会議

  ポスター発表


• Could the biogenic zinc oxide nanoparticles inhibit the ATPase activity of ABC transporters?

  Aliaa M. Radwan, Mai M. El-Keiy, Tarek M. Mohamed, 木村 哲就

  第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 英語, 日本生物物理学会, オンライン, 国内会議, 国際共著している

  ポスター発表


• Reconistitution of Cecytb-2 in Phospholipid Bilayer Nanodisc and Meaurments of its Ferric Reductase Activity

  Hamed A. Abosharaf, 坂本 有輝, Mohammed El behery, Thoria Diab, Tarek M. Mohamed, 木村 哲就, 鍔木 基成

  第58回日本生物物理学会年会, 2020年09月, 英語, 日本生物物理学会, オンライン, 国内会議, 国際共著している

  ポスター発表


• 高速分子動画撮影を補完する時間分解分光測定法の開発と微結晶タンパク質試料への応用

  木村 哲就

  第93回生化学会大会, 2020年09月, 日本語, 日本生化学会, オンライン, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• Observation of Structural Change Of α-Synuclein, an Intrinsically Disordered Protein by Fluorescence Lifetime Measurement

  笹田 航, 藤井 宏一, 松原 亮介, 木村 哲就

  第20回日本蛋白質科学会, 2020年07月, 英語, 日本蛋白質科学会, 誌上, 国内会議

  ポスター発表


• Membrane Protein Dynamics Studied by Time-resolved Measurements

  木村哲就

  Indo-Japan Joint Workshop “Frontiers in Molecular Spectroscopy: From Fundamentals to Applications in Chemistry and Biology”, 2019年11月, 英語, 神戸市, 国際会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• Complex Formation and Heme Transport of BhuUV-T Investigated by Time-Resolved UV/vis Spectroscopy

  Tetsunari Kimura

  2019 Summer Progress Report Meeting Cellular Regulation Laboratory, Univ. Hyogo, 2019年08月, 英語, Univ. Hyogo, 国内会議

  口頭発表（一般）


• 蛍光寿命測定によるヘリックスバンドルタンパク質ACBP の構造不均一性

  藤井 宏一, 松原 亮介, 鍔木 基成, 木村 哲就

  第19回日本蛋白質科学会年会･第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会, 2019年06月, 日本語, 神戸国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• ナノディスク再構成型ヘムABC トランスポーターを用いた基質輸送機構の分光学的解析

  浅田 拓也, 鍔木 基成, 城 宜嗣, 杉本 宏, 木村 哲就

  第19回日本蛋白質科学会年会･第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会, 2019年06月, 日本語, 神戸国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• Elucidation of molecular functions of human tumor suppressor protein 101F6 by reconstitution into phospholipid bilayer nanodiscs

  Mohamed El-Behery, Akikazu Asada, Fusako Takeuchi, Tetsunari Kimura, Eri Chatani, ○Motonari Tsubaki

  34TH PHILIPPINE CHEMISTRY CONGRESS, 2019年05月, 英語, Waterfront Hotel and Convention Center（Philippines）, 国際会議

  口頭発表（一般）


• タンパク質の化学的ダイナミズム

  木村 哲就

  第9回K-CONNEX研究会, 2019年03月, 日本語, 神戸大学六甲台第1キャンパスアカデミア館5階504 特別演習室, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• SPring-8における時間分解分光計測系の構築とタンパク質の分子機構解析への応用

  木村 哲就

  第38回SPring-8先端利用技術ワークショップ〜SPring-8放射光実験の生物・材料・無機化学への応用〜, 2019年02月, 日本語, 神戸大学 六甲台キャンパス 自然科学総合研究棟1号館, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• 部位特異的スピンラベルEPR分光法によるABCトランスポーター; BhuUVの構造変化測定

  大西 萌, 小堀 康博, 城 宜嗣, 杉本 宏, 鍔木 基成, 木村 哲就

  神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ『非共有結合系の分子科学：計測技術から探る生体分子科学の新展開』, 2019年01月, 日本語, 神戸大学 六甲台キャンパス 理学部Z201, 205号室, 国内会議

  ポスター発表


• 蛍光寿命計測によるACBPのフォールディング機構解析

  藤井 宏一, 松原 亮介, 鍔木 基成, 木村 哲就

  神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ『非共有結合系の分子科学：計測技術から探る生体分子科学の新展開』, 2019年01月, 日本語, 神戸大学 六甲台キャンパス 理学部Z201, 204号室, 国内会議

  ポスター発表


• マイクロ流路ミキサーを利用したタンパク質の実時間観察

  木村 哲就

  神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ『非共有結合系の分子科学：計測技術から探る生体分子科学の新展開』, 2019年01月, 日本語, 神戸大学 六甲台キャンパス 理学部Z201, 202号室, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• Spectroscopic studies on the transport mechanism of heme ABC transporter

  林 沙英, 城 宜嗣, 杉本 宏, 鍔木 基成, 木村 哲就

  神戸大学先端融合研究環境環ワークショップ『非共有結合系の分子科学：計測技術から探る生体分子科学の新展開』, 2019年01月, 日本語, 神戸大学 六甲台キャンパス 理学部Z201, 203号室, 国内会議

  ポスター発表


• 部位特異的スピンラベルEPR分光法によるABCトランスポーター;BhuUVの構造変化の実時間測定

  大西 萌, 鍔木 基成, 小堀 康博, 木村 哲就

  神戸大学 研究基盤センター 若手フロンティア研究会2018, 2018年12月, 日本語, 神戸大学百年記念館, 国内会議

  ポスター発表


• 蛍光寿命計測によるアシルCoA結合タンパク質のフォールディング機構解析

  藤井 宏一, 松原 亮介, 鍔木 基成, 木村 哲就

  若手フロンティア研究会2018, 2018年12月, 日本語, 神戸大学百年記念館, 国内会議

  ポスター発表


• 分光法による膜タンパク質のダイナミクス観察

  木村 哲就

  平成30 年度膜タンパク質研究会, 2018年10月, 日本語, 淡路夢舞台国際会議場, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• Membrane proteins in action; Structural and functional dynamics revealed by time-resolved measurements.

  KIMURA TETSUNARI

  International Congress on Pure and Applied Chemistry 2018, 2018年10月, 英語, Langkawi, Malaysia, 国際会議

  口頭発表（基調）


• 線虫Cytochrome b561ホモログCecytb-2のアスコルビン酸由来電子伝達反応解析

  福澤 美咲, 藤村 美香, 三浦 雅央, 木村 哲就, 鍔木 基成

  第91回日本生化学会大会, 2018年09月, 日本語, 国立京都国際会館, 国内会議

  ポスター発表


• Vibrational analysis for studying ion-protein interactions of a magnesium ion channel, MgtE

  Tetsunari Kimura, Victor Lorenz-Fonfria, Shintaro Doki, Hideyoshi Motoki, Ryuichiro Ishitani, Osamu Nureki, Masahiro Higashi, ○Yuji Furutan

  第56回日本生物物理学会年会, 2018年09月, 英語, 岡山大学 津島キャンパス, 国内会議

  ポスター発表


• Real-time measurements of the conformational changes in ABC transporter; BhuUV, revealed by site-directed spin-labeling EPR spectroscopy

  ○Kizashi Onishi, Motonari Tsubaki, Yasuhiro Kobori, Tetsunari Kimura

  第56回日本生物物理学会年会, 2018年09月, 英語, 岡山大学 津島キャンパス, 国内会議

  ポスター発表


• Folding dynamics of acyl-CoA binding protein revealed by fluorescence lifetime measurements

  ○Koichi Fujii, Motonari Tsubaki, Tetsunari Kimura

  第56回日本生物物理学会年会, 2018年09月, 英語, 岡山大学 津島キャンパス, 国内会議

  ポスター発表


• Direct observation of the enzymatic reaction catalyzed by an integral membrane NO reductase using microflow-flash IR spectroscopy

  Hanae Takeda, Tetsunari Kimura, Takashi Nomura, Shoko Ishii, Akiko Matsubayashi, Azusa Yokota, Takehiko Tosha, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo

  第56回日本生物物理学会年会, 2018年09月, 英語, 岡山大学 津島キャンパス, 国内会議

  口頭発表（一般）


• Cytochrome b561ホモログ・線虫Cecytb-2の三価鉄還元酵素活性の分子機構

  藤村 美香, 三浦 雅央, 木村 哲就, 鍔木 基成

  第91回日本生化学会大会, 2018年09月, 日本語, 国立京都国際会館, 国内会議

  ポスター発表


• Analyses on the ascorbate-specific electron transfer function of Cecytb-2, a cytochrome b561 homolog in Caenorhabditis elegans

  ○Misaki Fukuzawa, Mika Fujimura, Masahiro Miura, Tetsunari Kimura, Motonari Tsubaki

  第56回日本生物物理学会年会, 2018年09月, 英語, 岡山大学 津島キャンパス, 国内会議

  ポスター発表


• 線虫Cytohrome b561ホモログCecytb-2分子機能解析

  福澤 美咲, 藤村 美香, 三浦 雅央, 木村 哲就, 鍔木 基成

  若手フロンティア研究会2017, 2017年12月, 日本語, 神戸大学研究基盤センター、神戸大学百年記念館, 国内会議

  ポスター発表


• 線虫Cytochrome b561ホモログCecytb-2のアスコルビン酸からの電子伝達機能解析

  福澤 美咲, 藤村 美香, 三浦 雅央, 鍔木 基成, 木村 哲就

  2017年度生命科学系学会合同年次大会, 2017年12月, 日本語, 神戸ポートアイランド, 国内会議

  ポスター発表


• ヘムABCトランスポーターの輸送機構に関する分光学的研究

  林 沙英, 木村

  2017年度生命科学系学会合同年次大会, 2017年12月, 日本語, 神戸ポートアイランド, 国内会議

  ポスター発表


• Cytochrome b561ホモログ・線虫Cecytb-2の分子機能解明

  藤村 美香, 三浦 雅央, 木村 哲就, 鍔木 基成

  2017年度生命科学系学会合同年次大会, 2017年12月, 日本語, 神戸ポートアイランド, 国内会議

  ポスター発表


• ABCトランスポーターのヘム輸送機構解析

  林 沙英, 杉本 宏, 城 宜嗣, 池本 夕佳, 鍔木 基成, 木村 哲就

  若手フロンティア研究会2017, 2017年12月, 日本語, 神戸大学研究基盤センター、神戸大学百年記念館, 国内会議

  ポスター発表


• 線虫Cytochrome b561ホモログ・Cecytb-2の分子機能解明

  藤村 美香, 三浦 雅央, 木村 哲就, 鍔木 基成

  第55回日本生物物理学会年会, 2017年09月, 日本語, 熊本大学 黒髪北地区, 国内会議

  ポスター発表


• 時間分解分光法によるABCトランスポーターの輸送とATP加水分解過程の直接観察

  木村 哲就, 林 沙英, 城 宜嗣, 杉本 宏, 池本 夕佳

  第55回日本生物物理学会年会, 2017年09月, 日本語, 熊本大学 黒髪北地区, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• 時間分解可視・赤外吸収分光法を用いた一酸化窒素還元酵素のNO還元反応機構の解明

  武田 英恵, 木村 哲就, 野村 高志, 松林 亜希子, 石井 頌子, 當舎 武彦, 城 宜嗣, 久保 稔

  第55回日本生物物理学会年会, 2017年09月, 日本語, 熊本大学 黒髪北地区, 国内会議

  ポスター発表


• 線虫cytochrome b561ホモログCecytb-2の分子機能解明

  藤村 美香, 三浦 雅央, 木村 哲就, 鍔木 基成

  若手フロンティア研究会2016, 2016年12月, 日本語, 神戸大学研究基盤センター, 神戸大学百年記念館、神戸、兵庫県, 国内会議

  ポスター発表


• マイクロ流路デバイスを用いた時間分解分光法による膜タンパク質の活性サイトの中間体構造解析

  Tetsunari Kimura

  シンポジウム:時空間精密構造解析による生体分子活性サイトの機能解明(第54回日本生物物理学会年会), 2016年11月, 英語, つくば国際会議場, 国内会議

  口頭発表（一般）


• ナノリットルフロー時間分解可視・赤外分光法を用いた一酸化窒素還元酵素の短寿命反応過渡種の計測

  Hanae Takeda, Tetsunari Kimura, Shoko Ishii, Takehiko Tosha, Yoshitsugu Shiro, Minoru Kubo

  第54回日本生物物理学会年会, 2016年11月, 英語, つくば国際会議場, 国内会議

  ポスター発表


• Cytochrome b561ホモログ・線虫Cecytb-2の分子機能解明

  藤村 美香, 三浦 雅央, 木村 哲就, 鍔木 基成

  第89回日本生化学会大会, 2016年09月, 日本語, 宮城県、仙台国際センター、東北大学, 国内会議

  ポスター発表


• マイクロ流路フロー・フラッシュ時間分解赤外分光法による一酸化窒素還元酵素の反応機構解析

  木村哲就, 武田英恵, 石井頌子, 當舎武彦, 城宜嗣, 久保稔

  生体分子科学討論会, 2016年06月, 日本語, 名古屋大学 野依記念学術交流館, 国内会議

  口頭発表（一般）


• NO reduction mechanism in the binuclear catalytic center of nitric oxide reductase revealed by novel micro-channel flow-flash spectrometers

  Tetsunari KIMURA, Hanae TAKEDA, Shoko ISHII, Takehiko TOSHA, Yoshitsugu SHIRO, Minoru KUBO

  Metallocofactors Gordon Research Conference, 2016年06月, 英語, Stonehill College Easton, MA, 国際会議

  ポスター発表


• Molecular mechanism of the catalytic reaction of NO reductase revealed by novel time-resolved visible/IR absorption spectrometers with microfluidic device.

  木村 哲就, 武田 英恵, 石井 頌子, 當舎 武彦, 城 宜嗣, 久保 稔

  Biophysical Soceity 60th Annual Meeting, 2016年02月, 英語, Biophysical Society, ロサンゼルス カリフォルニア 米国, Time-resolved (TR) spectroscopy plays convincing roles in clarifying the molecular mechanism of biological reactions in the atomic and electronic level. Most of the biological reactions can be triggered by the sudden changes in buffer conditions, but the time-resolution of the conventional solution-mixing technique is limited to several milliseconds and the sample consumption i, 国際会議

  ポスター発表


• Stopped-flow kinetic analysis of human duodenal cytochrome b561

  武田 英恵, 冨樫 ひろ美, 木村 哲就, Grant Mauk, 杉本 宏, 城 宜嗣SHIRO Yoshitsugu

  Pacifichem2015 (The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2015), 2015年12月, 英語, American Chemical Society, 日本化学会, 他5カ国の化学会, ホノルル ハワイ 米国, 国際会議

  ポスター発表


• Molecular mechanism of NO reduction by bacterial nitric oxide reductases

  城 宜嗣, 當舎 武彦, 木村 哲就, 久保 稔

  Pacifichem2015 (The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2015), 2015年12月, 英語, American Chemical Society, 日本化学会, 他5カ国の化学会, ホノルル ハワイ 米国, 国際会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• Development of a time-resolved visible/IR absorption spectrometer with a novel microfluidic device and its application to catalytic reaction of NO reductase.

  木村 哲就, 石井 頌子, 當舎 武彦, 城 宜嗣, 久保 稔

  Pacifichem2015 (The International Chemical Congress of Pacific Basin Societies 2015), 2015年12月, 英語, American Chemical Society, 日本化学会, 他5カ国の化学会, ホノルル ハワイ 米国, Time-resolved (TR) spectroscopy plays convincing roles in clarifying the molecular mechanism of biological processes in molecular and atomic level, and it has been applied to observe various photocyclic reactions with the laser flash technique. However, most of the biological reactions are non-photocyclic and irreversible, and the applications of TR spectroscopy to such reactio, 国際会議

  ポスター発表


• マイクロ流路を用いたフローフラッシュ赤外吸収分光法の開発と一酸化窒素還元酵素の反応中間体解析への応用

  木村 哲就, 石井 頌子, 當舎 武彦, 城 宜嗣, 久保 稔

  日本生物物理学会第52回年会, 2015年09月, 英語, 日本生物物理学会, 金沢大学, Characterization of the transient intermediates in the chemical and biological reactions is essential to clarify their molecular mechanisms. In this research, we have developed an infrared spectroscopic system by combining laser spectroscopy and micro-channel flow-cell, which enabled us to monitor the irreversible enzymatic reaction of low-yield membrane protein with the nanose, 国内会議

  口頭発表（一般）


• マイクロ流体フロー・フラッシュ赤外分光測定系による一酸化窒素還元酵素の触媒反応の実時間観察

  木村 哲就, 石井 頌子, 當舎 武彦, 城 宜嗣, 久保 稔

  第9回分子科学討論会, 2015年09月, 日本語, 分子科学会, 東京工業大学, 酵素反応の分子機構解明には、反応過程の実時間観察が重要な役割を果たす。しかし、従来の装置では基質の結合から始まる酵素反応の動的過程においてミリ秒以内に生成する反応初期の中間体を観測することは困難である。そこで、マイクロ流体デバイスと赤外レーザーを組み合わせたフロー・フラッシュ赤外分光測定系を開発し、マイクロ秒の時間分解能での観察を可能にした。本研究では、装置を一酸化窒素還元酵素(NOR)に応用し、ヘム鉄・鉄原子から構成される活性中心においてNOがN2Oへと還元される触媒反応過程を、基質のNO伸縮振動・NN伸縮振動に着目して追跡した。当日は、速度論的解析と併せ、NORの反応機構について議論する。, 国内会議

  口頭発表（一般）


• マイクロ流体フローを用いた一酸化窒素還元酵素の触媒反応の動的分光観察 (招待講演)

  木村 哲就

  第15回日本蛋白質科学会年会, 2015年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, 徳島市, 一酸化窒素還元酵素は、ヘム鉄と非ヘム鉄からなる活性中心で2分子のNOをN2Oに還元する膜蛋白質であり、細胞毒性の高いNOを速やかに無毒化する。近年、我々は結晶構造解析から、本酵素の活性中心の構造や電子・プロトン供給経路を明らかにした。一方、反応機構に関しては、これまでに、(i) 2分子のNOがヘム鉄と非ヘム鉄それぞれに結合した後、N-N間に共有結合が形成されるtrans機構と、(ii) 1分子のNOがヘム鉄と非ヘム鉄を架橋するように結合した後、2分子目のNOがNOを攻撃するcis機構が提案されており、まだ議論がなされている。これは機構解明の鍵となる過渡的中間体; NO結合型が1 ms以内に生成・消失し、従来の方法では構造解析が不可能なためである。そこで、マイクロ秒の時間分解能での計測が可能な顕微可視・赤外吸収分光装置を新規に開発し、中間体を直接観察す, 国内会議

  [招待有り]

  口頭発表（招待・特別）


• マイクロ流体フローを用いた一酸化窒素還元酵素の触媒反応の動的分光観察 (ポスター)

  木村 哲就

  第15回日本蛋白質科学会年会, 2015年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, 徳島市, 一酸化窒素還元酵素は、ヘム鉄と非ヘム鉄からなる活性中心で2分子のNOをN2Oに還元する膜蛋白質であり、細胞毒性の高いNOを速やかに無毒化する。近年、我々は結晶構造解析から、本酵素の活性中心の構造や電子・プロトン供給経路を明らかにした。一方、反応機構に関しては、これまでに、(i) 2分子のNOがヘム鉄と非ヘム鉄それぞれに結合した後、N-N間に共有結合が形成されるtrans機構と、(ii) 1分子のNOがヘム鉄と非ヘム鉄を架橋するように結合した後、2分子目のNOがNOを攻撃するcis機構が提案されており、まだ議論がなされている。これは機構解明の鍵となる過渡的中間体; NO結合型が1 ms以内に生成・消失し、従来の方法では構造解析が不可能なためである。そこで、マイクロ秒の時間分解能での計測が可能な顕微可視・赤外吸収分光装置を新規に開発し、中間体を直接観察す, 国内会議

  ポスター発表


• ヒト由来鉄還元酵素 Dcytb の Stopped-Flow 法による機能解析

  武田 英恵, 冨樫 ひろ美, 木村 哲就, Grant Mauk, 城 宜嗣SHIRO Yoshitsugu, 杉本 宏

  第15回日本蛋白質科学会年会, 2015年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, 徳島市, 国内会議

  ポスター発表


• ケージド NO を用いた脱窒カビ由来 NO 還元酵素結晶における反応中間体の調製

  西田 拓真, 當舎 武彦, 坂口 美幸, 木村 哲就, 柳澤 幸子, 上野 剛, 村上 博則, 山本 雅貴, 小倉 尚志, 城 宜嗣, 久保 稔

  第15回日本蛋白質科学会年会, 2015年06月, 日本語, 日本蛋白質科学会, 徳島市, 国内会議

  ポスター発表

• 日本蛋白質科学会

  2003年 - 現在


• 生物物理学会（Biophysical Society, U.S.A.）

  2002年 - 現在


• 日本生物物理学会

  2000年 - 現在


• 日本化学会

• 新しい動的構造解析法の開発とABCトランスポーターへの応用

  杉本 宏, 木村 哲就

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 基盤研究(B), 国立研究開発法人理化学研究所, 2024年04月01日 - 2027年03月31日


• 炭素資源変換を可視化する単一分子反応イメージング技術の開発

  立川 貴士, 隈部 佳孝, 松原 亮介, 木村 哲就

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 国際共同研究加速基金(海外連携研究), 神戸大学, 2023年09月08日 - 2027年03月31日


• 時間分解測定法によるABCトランスポーター膜輸送機構の化学的解明

  木村 哲就

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(B), 基盤研究(B), 神戸大学, 2022年04月01日 - 2025年03月31日


• 病原菌ヘムトランスポーターの構造変化の追跡と基質輸送機構の解明

  杉本 宏, 木村 哲就

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(B), 基盤研究(B), 国立研究開発法人理化学研究所, 2021年04月01日 - 2024年03月31日

  病原菌は宿主に感染した際に、血液ヘモグロビンから鉄をヘムの形で奪い取り、増殖に必要な栄養素として利用している。そのため、ヘムの取り込みは感染症を抑制する上でも注目されてきた。本課題では、グラム陰性の病原性細菌でアデノシン三リン酸（ATP）依存的にペリプラズム空間から細胞質へとヘムの膜輸送を行うABCトランスポーターの構造変化に着目する。これまでの当グループによる研究で明らかにした結晶構造からは、分子の中心を通る基質輸送チャネルに大きな構造変化が起こることが示唆されたが、ヘムやATPが結合した状態での構造は未だに決定できていないせいもあり、メカニズムの理解が全く進んでいない。本年度は、ヘムトランスポーターによるヘム輸送の仕組みの全容を解明するために、クライオ電子顕微鏡によって、ヘムの輸送過程の各構造のスナップショットを取得することを目指した。休止型の状態のトランスポーター（ペリプラズムヘム結合タンパク質：膜貫通サブユニット：ヌクレオチド結合サブユニットの1:2:2複合体）は比較的安定した状態であるため、試料調整方法の確立とデータ収集をおこなった。ヘム結合型の複合体の状態で界面活性剤を両親媒性ポリマーに置換することで可溶化状態を維持すると観察グリッド上での単分散性が向上することを見出した。凍結試料のクライオ電子顕微鏡観察を行なった結果、低分解能ではあるが5つのサブユニットの配置や２次構造が確認できた。


• 時間分解構造解析を補完する精密顕微分光計測

  久保 稔, 木村 哲就, 古谷 祐詞

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型), 新学術領域研究(研究領域提案型), 兵庫県立大学, 2019年06月28日 - 2024年03月31日

  本研究では溶液測定に加えて、タンパク質微結晶を測定できる顕微分光技術を開発し、時分割結晶構造解析（分子動画法）と時分割分光法（紫外可視吸収分光、ラマン・赤外分光、蛍光分光）との相関的・補完的解析を推進する。多くの研究試料を扱うが、それらは新学術領域「高速分子動画」において研究されている試料である。以下、各分光法毎に本年度の装置開発実績及び研究実績を記す。
  ・紫外可視吸収分光：（微結晶測定）光遺伝学ツール・チャネルロドプシンの結晶相におけるダイナミクスを解明した。その分光データと時分割結晶構造解析との相関解析により、チャネルロドプシンの光誘起チャネル開口のメカニズムを解明した。新規ロドプシン類の測定も終えており、時分割結晶構造解析との相関解析を進めている。（溶液測定）顕微装置にマイクロ流路デバイスを組み込んだ極微量フロー測定により、嫌気呼吸の鍵酵素cNORの反応中間体同定に成功した。 ・赤外分光：（微結晶測定）微結晶に適用できる顕微時分割赤外分光装置の開発を完了した。N2O発生酵素P450norに装置を適用し、反応中間体の電子状態解明に成功した。（溶液測定）DNAフォトリアーゼの反応中間体を捉えることに成功した。現在、反応中間体の化学構造決定を目指し、同位体試料の測定を試みている。 ・ラマン分光：（微結晶測定）昨年度に引き続き、時分割顕微測定系の開発を進めている。一方、凍結結晶に対する測定系を整備し、P450酵素への適用を進めている。（溶液測定）二液混合系のstopped-flow測定装置を完成させた。 ・蛍光分光：（微結晶測定）二液混合系の時分割蛍光分光装置に分光器を導入した。今後、Ca2+感受性イクオリンに適用する。（溶液測定）Stopped-flow法を用いて、イクオリンの蛍光ダイナミクスを測定した。現在、発光過程の分子モデルを構築するための速度論解析を進めている。


• タンパク質ダイナミクス観測に資する高時空間分解能ESR・IR計測系の開発と応用

  木村 哲就

  科学研究費補助金／新学術領域研究, 2017年04月 - 2019年03月, 研究代表者

  競争的資金


• ヒト癌抑制遺伝子候補101F6によるレドックス擾乱細胞死誘導機構の解明

  鍔木 基成

  学術研究助成基金助成金／基盤研究(C), 2016年04月 - 2019年03月

  競争的資金


• マイクロ流体フロー時分割赤外分光光度計の開発と酵素反応の短寿命中間体の解析

  久保 稔, 當舎 武彦, 木村 哲就

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(B), 基盤研究(B), 国立研究開発法人理化学研究所, 2015年04月01日 - 2018年03月31日

  本研究では、これまで困難であった酵素反応の動的構造解析を実現する時分割赤外分光技術を確立した。20 nL単位で送液できる精密フローシステムを開発し、過去に開発したフェムト秒赤外レーザーベースの高感度赤外分光装置に組み込むことで、ケージド基質を用いた酵素反応のマイクロフロー・フラッシュ測定を可能にした。次に応用研究として、地球上の窒素循環を担う一酸化窒素還元酵素の酵素反応を時分割解析し、短寿命のNO結合型中間体の配位様式の解明に成功した。さらに、マイクロフロー・フラッシュ測定法をSACLAでの時分割結晶構造解析にも応用することで、NO結合型中間体の構造の可視化にも成功した。


• 新規時間分解計測法の開発とABCトランスポーターの分子機構解析への応用

  木村 哲就

  科学研究費補助金／若手研究(A), 2015年04月 - 2018年03月, 研究代表者

  競争的資金


• 哺乳動物イオンチャネルの機能的発現と分子機構解析

  古谷 祐詞, 中條 浩一, 塚本 寿夫, 木村 哲就, 久保 義弘

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 挑戦的萌芽研究, 分子科学研究所, 2012年04月01日 - 2014年03月31日

  イオンチャネル蛋白質は、様々な刺激に応じてイオンを選択的に透過することで生体電気信号の発生を制御する。このように重要な生理現象を担うイオンチャネルの機能発現の分子機構の解明には原子レベルでの構造情報が必要である。本研究では、医学・薬学分野で重要な哺乳動物由来のイオンチャネルに対して、分子の構造に詳細な情報を与える全反射赤外差分光解析を適用した。様々なカリウムチャネルの中から細胞の静止膜電位に関係するKCNK1チャネルが赤外分光解析に有望であることを明らかにし、イオン選択フィルタの構造情報を得ることに成功した。


• 低収量生体分子の時間分解計測を目指したマイクロ流体ミキサーの開発

  木村 哲就

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業 若手研究(A), 若手研究(A), 2011年04月01日 - 2014年03月31日

  生体分子反応がどのようなメカニズムで起こっているかを明らかにするためには、その反応を実時間で観察し、生体分子のダイナミクスを明らかにしなければならない。しかし、調製できるタンパク質の量には限りがあり、多くの場合マイクログラムからミリグラム程度であるため、このような低収量生体分子のメカニズムを明らかにする研究は進んで来なかった。本課題では新規の計測系を構築することで、低収量生体分子が起こす反応の時間分解計測を可能にした。


• 時間分解赤外分光法を用いた膜蛋白質フォールディング機構の解明

  木村 哲就

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業 研究活動スタート支援, 研究活動スタート支援, 分子科学研究所, 2010年 - 2011年

  本申請研究は、光開裂・解離性分子をβバレル膜蛋白質OmpAに修飾することで蛋白質構造に大きな摂動を加え、それによって引き起こされた変性状態からのフォールディングを生理的条件に近い温度・pH・塩濃度環境下において追跡することを目的とした。そこで、まずOmpAのβバレル構造ドメインの遺伝子配列をpETベクターに組み込んだプラスミドを作成し、そのプラスミドを形質転換した大腸菌を用いることによって発現を試みた。OmpAのβバレルドメインの発現をSDS-PAGEによって確認した。さらに簡便な精製を目的としてHisタグをC末端側に導入したプラスミドを作成すると同時に、システイン残基を導入した変異体の作製も行った。今後、光解離性分子によるOmpAの修飾を行い、構造を詳細に検討する予定である。一方、フォールディング反応に伴う膜蛋白質の構造変化に関する詳細な情報を得るためには、時間分解赤外差スペクトル分光測定を駆使する予定である。さらには、フォールディングキネティクスの解析には、得られた一連の赤外差スペクトルに対してSVD解析とグローバルフィッティング法を用いて、中間体の構造も含めて検討する必要がある。そこで、αヘリックスから構成される膜蛋白質pHRに関して、その光反応サイクルを実時間観察し、詳細な解析を行うことによって、膜蛋白質構造において起こる変化を追跡することを試みた。その結果、溶媒から隔離されたヘリックスの構造変化が光反応サイクルの後期に起こることがわかった。この予備実験により、よりドラスティックな構造変化であるフォールディング反応を時間分解赤外差スペクトル分光測定によってとらえることができると期待される。


• マイクロ秒分割分光装置を用いた蛋白質の折り畳み機構の解明

  基礎科学特別研究員研究費, 2003年 - 2005年

  競争的資金


• 圧力効果を利用した蛋白質の折り畳み機構における水分子ダイナミクスの直接観察

  基礎科学特別研究員研究費, 2005年

  競争的資金