Research activity information

• Mechanical control of osteoclast fusion by membrane-cortex attachment and BAR proteins.

  Yumeng Wan, Yuri L Nemoto, Tsukasa Oikawa, Kazunori Takano, Takahiro K Fujiwara, Kazuya Tsujita, Toshiki Itoh

  Osteoclasts are multinucleated giant cells that are formed by the fusion of precursor cells. Cell-cell fusion is mediated by membrane protrusion driven by actin reorganization, but the role of membrane mechanics in this process is unknown. Utilizing live-cell imaging, optical tweezers, manipulation of membrane-to-cortex attachment (MCA), and genetic interference, we show that a decrease in plasma membrane (PM) tension is a mechanical prerequisite for osteoclast fusion. Upon RANKL-induced differentiation, ezrin expression in fusion progenitor cells is reduced, resulting in a decrease in MCA-dependent PM tension. A forced elevation of PM tension by reinforcing the MCA conversely suppresses cell-cell fusion. Mechanistically, reduced PM tension leads to membrane protrusive invadosome formation driven by membrane curvature-inducing/sensing BAR proteins, thereby promoting cell-cell fusion. These findings provide insights into the mechanism of cell-cell fusion under the control of membrane mechanics.

  Lead, Jul. 2025, The Journal of cell biology, 224(7) (7), English, International magazine

  Scientific journal

  Link to Kobe Univ. Repository (Kernel)


• Role of membrane proximal actin regulators in SARS-CoV-2 spike-induced cell-cell fusion

  Linting Kou, Yumeng Wan, Yuri L. Nemoto, Kazuya Tsujita, Toshiki Itoh

  Apr. 2025, Biochemical and Biophysical Research Communications

  Scientific journal

  Link to Kobe Univ. Repository (Kernel)


• Ultrafast single-molecule imaging reveals focal adhesion nano-architecture and molecular dynamics

  Takahiro K. Fujiwara, Taka A. Tsunoyama, Shinji Takeuchi, Ziya Kalay, Yosuke Nagai, Thomas Kalkbrenner, Yuri L. Nemoto, Limin H. Chen, Akihiro C.E. Shibata, Kokoro Iwasawa, Ken P. Ritchie, Kenichi G.N. Suzuki, Akihiro Kusumi

  Using our newly developed ultrafast camera described in the companion paper, we reduced the data acquisition periods required for photoactivation/photoconversion localization microscopy (PALM, using mEos3.2) and direct stochastic reconstruction microscopy (dSTORM, using HMSiR) by a factor of ≈30 compared with standard methods, for much greater view-fields, with localization precisions of 29 and 19 nm, respectively, thus opening up previously inaccessible spatiotemporal scales to cell biology research. Simultaneous two-color PALM-dSTORM and PALM-ultrafast (10 kHz) single fluorescent-molecule imaging-tracking has been realized. They revealed the dynamic nanoorganization of the focal adhesion (FA), leading to the compartmentalized archipelago FA model, consisting of FA-protein islands with broad diversities in size (13-100 nm; mean island diameter ≈30 nm), protein copy numbers, compositions, and stoichiometries, which dot the partitioned fluid membrane (74-nm compartments in the FA vs. 109-nm compartments outside the FA). Integrins are recruited to these islands by hop diffusion. The FA-protein islands form loose ≈320 nm clusters and function as units for recruiting FA proteins.

  Aug. 2023, Journal of Cell Biology, 222(8) (8), English, International magazine

  Scientific journal


• iTRVZ: liquid nano-platform for signal integration on the plasma membrane

  Taka Aki Tsunoyama, Christian Hoffmann, Bo Tang, Koichiro M Hirosawa, Yuri L Nemoto, Rinsh S Kasai, Takahiro Fujiwara, Kenichi GN Suzuki, Dragomir Milovanovic, Akihiro Kusumi

  Signalling is one of the most important functions of the cellular plasma membrane (PM). A variety of extracellular signalling molecules bind to their specific receptors in the PM, and the engaged receptors in turn trigger various cytoplasmic signalling cascades. These signalling pathways are intertwined and affect each other, in a process called crosstalk, which enables the cells to fine tune the overall signal. The crosstalk of different receptor signalling pathways has been examined quite extensively, but the platform responsible for signal integration has never been discovered. Here, using single-molecule imaging, we found a nanometer-scale (50-80 nm) liquid-like protein assembly on the PM cytoplasmic surface (at a density of ~2-μm apart from each other on average, with a lifetime of ~10 s), working as the signal transduction and integration platform for receptors, including GPI-anchored receptors (GPI-ARs), receptor-type tyrosine kinases (RTKs), and GPCRs. The platform consists of integrin, talin, RIAM, VASP, and zyxin, and is thus termed iTRVZ. These molecules are known as focal-adhesion constituents, but iTRVZ is distinct from focal adhesions, because iTRVZ exists on both the apical and basal PMs and lack vinculin. The iTRVZ formation is driven by specific protein-protein interactions, liquid-liquid phase separation, and interactions with actin filaments and raft domains via PI(4,5)P2. iTRVZ integrates and amplifies the GPI-AR and RTK signals in a strongly non-linear fashion, and thus works as an AND gate and noise filter. These findings greatly advance our understanding of the mechanism for crosstalk between signalling pathways.

  Cold Spring Harbor Laboratory, Dec. 2021

  Scientific journal


• AMPA receptors in the synapse turnover by monomer diffusion

  Jyoji Morise, Kenichi G. N. Suzuki, Ayaka Kitagawa, Yoshihiko Wakazono, Kogo Takamiya, Taka A. Tsunoyama, Yuri L. Nemoto, Hiromu Takematsu, Akihiro Kusumi, Shogo Oka

  Abstract The number and subunit compositions of AMPA receptors (AMPARs), hetero- or homotetramers composed of four subunits GluA1–4, in the synapse is carefully tuned to sustain basic synaptic activity. This enables stimulation-induced synaptic plasticity, which is central to learning and memory. The AMPAR tetramers have been widely believed to be stable from their formation in the endoplasmic reticulum until their proteolytic decomposition. However, by observing GluA1 and GluA2 at the level of single molecules, we find that the homo- and heterotetramers are metastable, instantaneously falling apart into monomers, dimers, or trimers (in 100 and 200 ms, respectively), which readily form tetramers again. In the dendritic plasma membrane, GluA1 and GluA2 monomers and dimers are far more mobile than tetramers and enter and exit from the synaptic regions. We conclude that AMPAR turnover by lateral diffusion, essential for sustaining synaptic function, is largely done by monomers of AMPAR subunits, rather than preformed tetramers.

  Springer Science and Business Media LLC, Nov. 2019, Nature Communications, 10(1) (1), 5245 - 5245, English, International magazine

  Scientific journal


• Native prion protein homodimers are destabilized by oligomeric amyloid β 1-42 species as shown by single-molecule imaging.

  Tiwari SS, Shirai YM, Nemoto YL, Kojima K, Suzuki KGN

  Jan. 2018, Neuroreport

  Scientific journal


• Dynamic Meso-Scale Anchorage of GPI-Anchored Receptors in the Plasma Membrane: Prion Protein vs. Thy1

  Nemoto, Y.L., Morris, R.J., Hijikata, H., Tsunoyama, T.A., Shibata, A.C.E., Kasai, R.S., Kusumi, A., Fujiwara, T.K.

  Lead, 2017, Cell Biochemistry and Biophysics

  Scientific journal


• Chemical labelling for visualizing native AMPA receptors in live neurons

  Wakayama, S., Kiyonaka, S., Arai, I., Kakegawa, W., Matsuda, S., Ibata, K., Nemoto, Y.L., Kusumi, A., Yuzaki, M., Hamachi, I.

  2017, Nature Communications, 8

  Scientific journal


• Confined diffusion of transmembrane proteins and lipids induced by the same actin meshwork lining the plasma membrane

  Fujiwara, T.K., Iwasawa, K., Kalay, Z., Tsunoyama, T.A., Watanabe, Y., Umemura, Y.M., Murakoshi, H., Suzuki, K.G.N., Nemoto, Y.L., Morone, N., Kusumi, A.

  2016, Molecular Biology of the Cell, 27(7) (7)

  Scientific journal


• Transient GPI-anchored protein homodimers are units for raft organization and function

  Suzuki, K.G.N., Kasai, R.S., Hirosawa, K.M., Nemoto, Y.L., Ishibashi, M., Miwa, Y., Fujiwara, T.K., Kusumi, A.

  2012, Nature Chemical Biology, 8(9) (9)

  Scientific journal


• Archipelago architecture of the focal adhesion: Membrane molecules freely enter and exit from the focal adhesion zone

  Shibata, A.C.E., Fujiwara, T.K., Chen, L., Suzuki, K.G.N., Ishikawa, Y., Nemoto, Y.L., Miwa, Y., Kalay, Z., Chadda, R., Naruse, K., Kusumi, A.

  2012, Cytoskeleton

  Scientific journal

• The Biophysical Society of Japan

  Jun. 2017 - Present

• 再構成系から紐解く細胞融合シナプスの分子動態の解明

  根本 悠宇里

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 研究活動スタート支援, 神戸大学, 31 Aug. 2023 - 31 Mar. 2025

  本研究は、「細胞膜張力の制御」という観点から細胞―細胞間融合を実現する動的な分子メカニズムの解明を目的とする。使用する細胞―細胞間融合のモデルとして、最もシンプルな系の1つとして知られているウイルス感染細胞の系を選択した。申請者は、コロナウイルス（SARS-CoV-2）由来タンパク質Spikeの発現を制御することにより、人為的にウイルス感染細胞の細胞融合を再現できる細胞株を樹立した。はじめに、アクチン細胞骨格の制御因子の細胞融合に対する役割を阻害剤を用いて検証したところ、Arp2/3複合体がSpikeを介した細胞融合に必要なこと、反対にアクトミオシンの活性が細胞融合を阻害することを見出した。さらに、アクチン重合のマスター制御因子であるRac、Rhoの関与についても同様に検証したところ、RacとRhoの活性制御が細胞融合を担っていることが示唆された。次に、細胞膜直下でArp2/3複合体を介したアクチン重合を活性化し、細胞膜の変形とアクチン動態をコントロールしているBARタンパク質に着目した。BARスーパーファミリーの網羅的RNAiスクリーニングを行い、いくつかのBARタンパク質がSpikeを介した細胞融合に影響を与えることを確認した。現在、これらのBARタンパク質について、過剰発現の細胞株を作製してさらなる解析を行うとともに、人工生体膜を用いた再構成系でのライブイメージング実験の準備を進めている。


• 神経細胞膜・特殊ラフト領域の動的構造と機能の解明 : 1分子追跡による研究

  根本 悠宇里

  日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 特別研究員奨励費, 京都大学, 2009 - 2011

  神経細胞の細胞膜上での特殊ラフト領域の形成機構、およびその機能の理解のため、ラフト分子であるGPIアンカー型タンパク質のプリオンタンパク質(PrP)とThy-1をターゲット分子とし、1分子蛍光観察実験を行っている。この2種類のタンパク質は、神経細胞膜上の主要なGPIアンカー型タンパク質であるにもかかわらず、その機能にはまだ不明な点が多い。 細胞膜上でのPrPとThy-1の挙動を1分子レベルで調べるため、私は3種類のタグタンパク質(GFPタグ、ACPタグ、Haloタグ)を付加したPrP分子とThy-1分子(GFP-PrP、GFP-Thy-1、ACP-Thy-1、ACP-PrP、Halo-PrP、Halo-Thy-1)のDNAコンストラクトを作製し、これを初代培養神経細胞、および、チャイニーズハムスターの卵巣由来の株細胞(CHO-K1)にそれぞれトランスフェクションして、1分子蛍光観察を行った。 GFP、ACPまたはHaloを付加したPrP分子とThy-1分子の生細胞膜上での運動を、それぞれ統計的に解析したところ、2つの分子の拡散係数の違いは大きく、PrPはThy-1よりも1/2ほど小さい値を示した。さらに、CHO-K1細胞の細胞膜上のPrPは、拡散しては短時間の間、動きが鈍くなり、その後また動き出すという運動(一時停留)をThy-1よりも高頻度に行っている可能性があることがわかった。これら2つの分子の生細胞膜上での挙動の違いは、PrPとThy-1がそれぞれ細胞膜上に異なる特殊ラフト領域を形成していることを示唆しているのではないかと考えている。 Roger Morrisらのグループによって、免疫電顕の観察から「PrPとThy-1はそれぞれ異なるドメインに存在する」と報告されている。これを生細胞で直接的に確かめるため、私は、同一細胞膜上のPrPとThy-1を同時に1分子観察する実験系を立ち上げた。具体的には、一方のタンパク質をGFPタグ、他方をACPタグフュージョンタンパク質とし、共トランスフェクションした同一の神経細胞中での2色同時1分子蛍光観察を行った。トランスフェクション効率の向上、1分子蛍光観察に適した発現レベルの調整といった課題があったが、実験条件を確定させ、1分子観察と解析を進めた。また、コントロールとして、我々の研究室の以前の研究から、すでに非ラフト分子であることが分かっている脂質分子(Cy3-DOPE)も合わせて観察、解析した。 さらにPALM/STORM顕微鏡法という新たな手法を用いた実験にも着手している。この方法を用いると回折限界以上の数十nmという超解像度でのイメージングが可能になる。このPALM/STORM顕微鏡法を生きた神経細胞での観察に応用し、GPIアンカー型タンパク質が微小なドメインを形成している可能性を示唆する結果を得た。