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那須野 亮先端バイオ工学研究センター准教授
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研究活動情報
■ 受賞- 2018年05月 日本NO学会, 第18回日本NO学会Young Investigator Awards優秀賞, 酵母における銅代謝関連転写因子 Mac1 を介した NO による高温ストレス耐性機 構
- 2017年07月 公益社団法人日本生化学会, JB論文賞, Structure-based molecular design for thermostabilization of N-acetyltransferase Mpr1 involved in a novel pathway of L-arginine synthesis in yeast
- 2012年12月 日本生化学会, 鈴木紘一メモリアル賞, 酵母の酸化ストレス耐性に関与するN-アセチルトランスフェラーゼMpr1の構造機能解析
- Metallothionein (MT), which is a small metal-binding protein with cysteine-rich motifs, functions in the detoxification of heavy metals in a variety of organisms. Even though previous studies suggest that MT is involved in the tolerance mechanisms against nitrosative stress induced by toxic levels of nitric oxide (NO) in mammalian cells, the physiological functions of MT in relation to NO have not been fully understood. In this study, we analyzed the functions of MT in nitrosative stress tolerance in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Our phenotypic analyses showed that deletion or overexpression of the MT-encoding gene, CUP1, led to higher sensitivity or tolerance to nitrosative stress in S. cerevisiae cells, respectively. We further examined whether the yeast MT Cup1 in the cell-free lysate scavenges NO. These results showed that the cell-free lysate containing a higher level of Cup1 degraded NO more efficiently. On the other hand, the transcription level of CUP1 was not affected by nitrosative stress treatment. Our findings suggest that the yeast MT Cup1 contributes to nitrosative stress tolerance, possibly as a constitutive rather than an inducible defense mechanism.2023年08月, Microbial cell (Graz, Austria), 10(8) (8), 170 - 177, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- Nitric oxide as a signaling molecule exerts cytotoxicity known as nitrosative stress at its excess concentrations. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cellular responses to nitrosative stress and their molecular mechanisms are not fully understood. Here, focusing on the posttranslational modifications that are associated with nitrosative stress response, we show that nitrosative stress increased the protein S-glutathionylation level in yeast cells. Our proteomic and immunochemical analyses demonstrated that the fructose-1,6-bisphosphate aldolase Fba1 underwent S-glutathionylation at Cys112 in response to nitrosative stress. The enzyme assay using a recombinant Fba1 demonstrated that S-glutathionylation at Cys112 inhibited the Fba1 activity. Moreover, we revealed that the cytosolic glutaredoxin Grx1 reduced S-glutathionylation of Fba1 and then recovered its activity. The intracellular contents of fructose-1,6-bisphosphate and 6-phosphogluconate, which are a substrate of Fba1 and an intermediate of the pentose phosphate pathway (PPP), respectively, were increased in response to nitrosative stress, suggesting that the metabolic flow was switched from glycolysis to PPP. The cellular level of NADPH, which is produced in PPP and functions as a reducing force for nitric oxide detoxifying enzymes, was also elevated under nitrosative stress conditions, but this increase was canceled by the amino acid substitution of Cys112 to Ser in Fba1. Furthermore, the viability of yeast cells expressing Cys112Ser-Fba1 was significantly lower than that of the wild-type cells under nitrosative stress conditions. These results indicate that the inhibition of Fba1 by its S-glutathionylation changes metabolism from glycolysis to PPP to increase NADPH production, leading to nitrosative stress tolerance in yeast cells.2022年11月, Free radical biology & medicine, 193(Pt 1) (Pt 1), 319 - 329, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- Fungi are ubiquitously present in our living environment and are responsible for crop and infectious diseases. Developing new antifungal agents is constantly needed for their effective control. Here, we investigated fungal cellular responses to an array of antifungal compounds, including plant- and bacteria-derived antifungal compounds. The pathogenic fungus Aspergillus fumigatus generated reactive oxygen species in its hyphae after exposure to the antifungal compounds thymol, farnesol, citral, nerol, salicylic acid, phenazine-1-carbonic acid, and pyocyanin, as well as under oxidative and high-temperature stress conditions. The production of nitric oxide (NO) was determined using diaminofluorescein-FM diacetate (DAF-FM DA) and occurred in response to antifungal compounds and stress conditions. The application of reactive oxygen species or NO scavengers partly suppressed the inhibitory effects of farnesol on germination. However, NO production was not detected in the hyphae using the Greiss method. An LC/MS analysis also failed to detect DAF-FM-T, a theoretical product derived from DAF-FM DA and NO, in the hyphae after antifungal treatments. Thus, the cellular state after exposure to antifungal agents may be more complex than previously believed, and the role of NO in fungal cells needs to be investigated further.2022年08月, Scientific reports, 12(1) (1), 13516 - 13516, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- Nitric oxide (NO) is a ubiquitous signaling molecule, and thus a variety of methods have been developed for its detection and quantification. Fluorometric analyses using a fluorescent NO probe harboring an o-phenylenediamine (OPD) structure are widely used for NO analyses in various organisms, including yeast. Here, we discovered that an NO-independent fluorophore (UNK436) was generated from a fluorescent NO probe 4-amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein (DAF-FM), which has an OPD structure, in yeast cells. The molecules responsible for this undesirable fluorescence and their reaction mechanisms were analyzed. Our mass spectrometric analysis showed that two carbon atoms from glucose were incorporated into UNK436. Subsequent analyses indicated that a non-proteinous small compound leads to the synthesis of UNK436 through an oxidative reaction. Furthermore, our LC/MS/MS analysis of the reaction mixture of DAF-FM with acetaldehyde in combination with stable isotope labeling demonstrated that acetaldehyde reacts with DAF-FM oxidatively, generating UNK436. Another NO probe with an OPD structure, diaminorhodamine-4M, reacted with acetaldehyde in the same way to emit fluorescence. Based on our findings, we recommend that in researches using OPD-based fluorescent NO probes, alternative analyses also be performed to identify the reaction products of the probes with NO to avoid false-positives.2022年07月, Free radical biology & medicine, 187, 29 - 37, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- Nitric oxide (NO) functions in cell protection or cell death, depending on its concentration. Therefore, regulation of the intracellular concentrations of NO by its degradation systems is important for cellular functions. One of the NO degrading enzymes, flavohemoglobin (FHb), which has NO dioxygenase (NOD) activity, is a promising target for antibiotics, based on the finding that FHb-deficient pathogens exhibited reduced host toxicity. Here, we developed a high-throughput method to measure the NOD activity. Our newly developed method could contribute to the screening of potential antibiotics with NOD inhibitory activity.2022年03月, The Journal of general and applied microbiology, 68(1) (1), 38 - 41, 英語, 国内誌研究論文（学術雑誌）
- Protein tyrosine nitration (PTN), in which tyrosine (Tyr) residues on proteins are converted into 3-nitrotyrosine (NT), is one of the post-translational modifications mediated by reactive nitrogen species (RNS). Many recent studies have reported that PTN contributed to signaling systems by altering the structures and/or functions of proteins. This study aimed to investigate connections between PTN and the inhibitory effect of nitrite-derived RNS on fermentation ability using the yeast Saccharomyces cerevisiae. The results indicated that RNS inhibited the ethanol production of yeast cells with increased intracellular pyruvate content. We also found that RNS decreased the activities of pyruvate decarboxylase (PDC) as a critical enzyme involved in ethanol production. Our proteomic analysis revealed that the main PDC isozyme Pdc1 underwent the PTN modification at Tyr38, Tyr157, and Tyr344. The biochemical analysis using the recombinant purified Pdc1 enzyme indicated that PTN at Tyr157 or Tyr344 significantly reduced the Pdc1 activity. Interestingly, the substitution of Tyr157 or Tyr344 to phenylalanine, which is no longer converted into NT, recovered the ethanol production under the RNS treatment conditions. These findings suggest that nitrite impairs the fermentation ability of yeast by inhibiting the Pdc1 activity via its PTN modification at Tyr157 and Tyr344 of Pdc1.2022年03月, Scientific reports, 12(1) (1), 4664 - 4664, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- Reactive nitrogen species (RNS) are signal molecules involved in various biological events; however, excess levels of RNS cause nitrosative stress, leading to cell death and/or cellular dysfunction. During the process of infection, pathogens are exposed to nitrosative stress induced by host-derived RNS. Therefore, the nitrosative stress resistance mechanisms of pathogenic microorganisms are important for their infection and pathogenicity, and could be promising targets for antibiotics. Previously, we demonstrated that the RIB1 gene encoding GTP cyclohydrolase II (GCH2), which catalyzes the first step of the riboflavin biosynthesis pathway, is important for nitrosative stress resistance in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Here, we identified and characterized the RIB1 gene in the opportunistic pathogenic yeast Candida glabrata. Our genetic and biochemical analyses indicated that the open reading frame of CAGL0F04279g functions as RIB1 in C. glabrata (CgRIB1). Subsequently, we analyzed the effect of CgRIB1 on nitrosative stress resistance by a growth test in the presence of RNS. Overexpression or deletion of CgRIB1 increased or decreased the nitrosative stress resistance of C. glabrata, respectively, indicating that GCH2 confers nitrosative stress resistance on yeast cells. Moreover, we showed that the proliferation of C. glabrata in cultures of macrophage-like cells required the GCH2-dependent nitrosative stress detoxifying mechanism. Additionally, an infection assay using silkworms as model host organisms indicated that CgRIB1 is indispensable for the virulence of C. glabrata. Our findings suggest that the GCH2-dependent nitrosative stress detoxifying mechanism is a promising target for the development of novel antibiotics.2022年, Frontiers in microbiology, 13, 825121 - 825121, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- Nitric oxide (NO) is a ubiquitous signaling molecule in various organisms. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, NO functions in both cell protection and cell death, depending on its concentration. Thus, it is important for yeast cells to strictly regulate NO concentration. The transcription factor Fzf1, containing five zinc fingers, is reportedly important for NO homeostasis by regulating the expression of the YHB1 gene, which encodes NO dioxygenase. However, the mechanism by which NO activates Fzf1 is still unclear. In this study, we showed that NO activated Fzf1 specifically at the protein level by RT-qPCR and Western blotting. Our further transcriptional analyses indicated that cysteine residues in the fourth zinc finger (ZF4) are required for the NO-responsive activation of Fzf1. Additionally, the present results suggest that ZF4 is important for the protein stability of Fzf1. From these results, we proposed possible mechanisms underlying Fzf1 activation.Wiley, 2021年07月, Genes to Cells, 26(10) (10), 823 - 829, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- The reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), which is required for various redox systems involving antioxidative stress enzymes, is thus important for stress tolerance mechanisms. Here, we analyzed the stress response of the NADPH-depleted cells of Saccharomyces cerevisiae. A cell viability assay showed that the NADPH depletion induced by disruption of the ZWF1 gene encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase, which is the major determinant of the intracellular NADPH/NADP+ ratio, enhanced the tolerance of S. cerevisiae to both oxidative and nitrosative stresses. The subsequent analyses demonstrated that the antioxidative transcriptional factor Yap1 was activated and the cytosolic catalase Ctt1, whose expression is regulated by Yap1, was upregulated in zwf1Δ cells irrespective of the presence or absence of stress stimuli. Moreover, deletion of the YAP1 or CTT1 gene inhibited the increased stress tolerance of zwf1Δ cells, indicating that Ctt1 dominantly contributed to the higher stress tolerance of zwf1Δ cells. Our findings suggest that an NADPH-independent mechanism enhances oxidative and nitrosative stress tolerance in ZWF1-lacking yeast cells.Wiley, 2021年07月, Yeast, 38(7) (7), 414 - 423, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- Oxford University Press (OUP), 2021年06月, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 85(9) (9), 2084 - 2088, 英語, 国際誌
ABSTRACT We showed that the isobutanol sensitivity in glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae was rescued by an alternative NADPH producer, acetaldehyde dehydrogenase, but not in the cells lacking 6-phosphogluconate dehydrogenase. This phenotype correlated with the intracellular NADPH/NADP+ ratio in yeast strains. Our findings indicate the importance of NADPH for the isobutanol tolerance of yeast cells.研究論文（学術雑誌） - Oxford University Press (OUP), 2021年02月, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 85(2) (2), 211 - 214, 英語, 国際誌
ABSTRACT Nitric oxide (NO) is a ubiquitous signaling molecule synthesized from various nitrogen sources. An analytical method to identify a nitrogen source for NO generation was developed using liquid chromatography with tandem mass spectrometry in combination with stable isotope labeling. Our method successfully detected the 15N-labeled NO-containing compound generated from 15N-labeled substrate nitrite in vitro and in vivo.研究論文（学術雑誌） - We previously reported that intracellular proline (Pro) confers tolerance to ethanol on the yeast Saccharomyces cerevisiae. In this study, to improve the ethanol productivity of sake, a traditional Japanese alcoholic beverage, we successfully isolated several Pro-accumulating mutants derived from diploid sake yeast of S. cerevisiae by a conventional mutagenesis. Interestingly, one of them (strain A902-4) produced more than 10-fold greater amounts of ornithine (Orn) and Pro compared to the parent strain (K901). Orn is a non-proteinogenic amino acid and a precursor of both arginine (Arg) and Pro. It has some physiological functions, such as amelioration of negative states such as lassitude and improvement of sleep quality. We also identified a homo-allelic mutation in the ARG5,6 gene encoding the Thr340Ile variant N-acetylglutamate kinase (NAGK) in strain A902-4. The NAGK activity of the Thr340Ile variant was extremely insensitive to feedback inhibition by Arg, leading to intracellular Orn accumulation. This is the first report of the removal of feedback inhibition of NAGK activity in the industrial yeast, leading to high levels of intracellular Orn. Moreover, sake and sake cake brewed with strain A902-4 contained 4-5 times more Orn than those brewed with strain K901. The approach described here could be a practical method for the development of industrial yeast strains with overproduction of Orn.2020年11月, Metabolic engineering, 62, 1 - 9, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule involved in various biological phenomena in many organisms. The physiological functions and metabolism of NO in yeast, a unicellular microorganism, are still unknown, mainly because it is difficult to analyze the intracellular NO levels accurately. Here, we developed a new method of more accurately measuring NO content in yeast cells with the detection limit of 6 nM, by treating the cells with an NO-specific fluorescence probe followed by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC/FLD). This approach successfully detected and quantified the NO content inside yeast cells treated with an NO donor. Moreover, the HPLC/FLD analysis indicates that the fluorescence induced under some environmental stress conditions, such as ethanol, vanillin, and heat-shock, was not derived from NO. The HPLC/FLD method developed in this study provides a new strategy for measuring the intracellular NO concentration with higher accuracy.Elsevier BV, 2020年06月, Analytical Biochemistry, 598, 113707 - 113707, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- The biological functions of nitric oxide (NO) depend on its concentration, and excessive levels of NO induce various harmful situations known as nitrosative stress. Therefore, organisms possess many kinds of strategies to regulate the intracellular NO concentration and/or to detoxify excess NO. Here, we used genetic screening to identify a novel nitrosative stress tolerance gene, RIB1, encoding GTP cyclohydrolase II (GTPCH2), which catalyzes the first step in riboflavin biosynthesis. Our further analyses demonstrated that the GTPCH2 enzymatic activity of Rib1 is essential for RIB1-dependent nitrosative stress tolerance, but that riboflavin itself is not required for this tolerance. Furthermore, the reaction mixture of a recombinant purified Rib1 was shown to quench NO or its derivatives, even though formate or pyrophosphate, which are byproducts of the Rib1 reaction, did not, suggesting that the reaction product of Rib1, 2,5-diamino-6-(5-phospo-D-ribosylamino)-pyrimidin-4(3 H)-one (DARP), scavenges NO or its derivatives. Finally, it was revealed that 2,4,5-triamino-1H-pyrimidin-6-one, which is identical to a pyrimidine moiety of DARP, scavenged NO or its derivatives, suggesting that DARP reacts with N2O3 generated via its pyrimidine moiety.2020年04月, Scientific reports, 10(1) (1), 6015 - 6015, 英語, 国際誌研究論文（学術雑誌）
- N-Acetyltransferase Mpr1 was originally discovered as an enzyme that detoxifies L-azetidine-2-carboxylate through its N-acetylation in the yeast Saccharomyces cerevisiae Σ1278b. Mpr1 protects yeast cells from oxidative stresses possibly by activating a novel L-arginine biosynthesis. We recently constructed a stable variant of Mpr1 (N203K) by a rational design based on the structure of the wild-type Mpr1 (WT). Here, we examined the effects of N203K on ethanol fermentation of the sake yeast S. cerevisiae strain lacking the MPR1 gene. When N203K was expressed in the diploid Japanese sake strain, its fermentation performance was improved compared to WT. In a laboratory-scale brewing, a sake strain expressing N203K produced more ethanol than WT. N203K also affected the contents of flavor compounds and organic acids. These results suggest that the stable Mpr1 variant contributes to the construction of new industrial yeast strains with improved fermentation ability and diversity of taste and flavor.2019年07月, Journal of industrial microbiology & biotechnology, 46(7) (7), 1039 - 1045, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Eukaryotes typically utilize two distinct aminoacyl-tRNA synthetase isoforms, one for cytosolic and one for mitochondrial protein synthesis. However, the genome of budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) contains only one cysteinyl-tRNA synthetase gene (YNL247W, also known as CRS1). In this study, we report that CRS1 encodes both cytosolic and mitochondrial isoforms. The 5' complementary DNA end method and GFP reporter gene analyses indicated that yeast CRS1 expression yields two classes of mRNAs through alternative transcription starts: a long mRNA containing a mitochondrial targeting sequence and a short mRNA lacking this targeting sequence. We found that the mitochondrial Crs1 is the product of translation from the first initiation AUG codon on the long mRNA, whereas the cytosolic Crs1 is produced from the second in-frame AUG codon on the short mRNA. Genetic analysis and a ChIP assay revealed that the transcription factor heme activator protein (Hap) complex, which is involved in mitochondrial biogenesis, determines the transcription start sites of the CRS1 gene. We also noted that Hap complex-dependent initiation is regulated according to the needs of mitochondrial energy production. The results of our study indicate energy-dependent initiation of alternative transcription of CRS1 that results in production of two Crs1 isoforms, a finding that suggests Crs1's potential involvement in mitochondrial energy metabolism in yeast.2019年07月, The Journal of biological chemistry, 294(37) (37), 13781 - 13788, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Since flavors of alcoholic beverages produced in fermentation process are affected mainly by yeast metabolism, the isolation and breeding of yeasts have contributed to the alcoholic beverage industry. To produce awamori, a traditional spirit (distilled alcoholic beverage) with unique flavors made from steamed rice in Okinawa, Japan, it is necessary to optimize yeast strains for a diversity of tastes and flavors with established qualities. Two categories of flavors are characteristic of awamori; initial scented fruity flavors and sweet flavors that arise with aging. Here we isolated a novel strain of Saccharomyces cerevisiae from hibiscus flowers in Okinawa, HC02-5-2, that produces high levels of alcohol. The whole-genome information revealed that strain HC02-5-2 is contiguous to wine yeast strains in a phylogenic tree. This strain also exhibited a high productivity of 4-vinyl guaiacol (4-VG), which is a precursor of vanillin known as a key flavor of aged awamori. Although conventional awamori yeast strain 101-18, which possesses the FDC1 pseudogene does not produce 4-VG, strain HC02-5-2, which has the intact PAD1 and FDC1 genes, has an advantage for use in a novel kind of awamori. To increase the contents of initial scented fruity flavors, such as isoamyl alcohol and isoamyl acetate, we attempted to breed strain HC02-5-2 targeting the L-leucine synthetic pathway by conventional mutagenesis. In mutant strain T25 with L-leucine accumulation, we found a hetero allelic mutation in the LEU4 gene encoding the Gly516Ser variant α-isopropylmalate synthase (IPMS). IPMS activity of the Gly516Ser variant was less sensitive to feedback inhibition by L-leucine, leading to intracellular L-leucine accumulation. In a laboratory-scale test, awamori brewed with strain T25 showed higher concentrations of isoamyl alcohol and isoamyl acetate than that brewed with strain HC02-5-2. Such a combinatorial approach to yeast isolation, with whole-genome analysis and metabolism-focused breeding, has the potentials to vary the quality of alcoholic beverages.2019年, Frontiers in genetics, 10, 490 - 490, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- Academic Press, 2018年01月, Advances in Microbial Physiology, 72, 29 - 63, 英語, 国際誌[査読有り]論文集(書籍)内論文
- 2016年11月, APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 100(22) (22), 9483 - 9497, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2016年07月, NITRIC OXIDE-BIOLOGY AND CHEMISTRY, 57, 85 - 91, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2016年02月, JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, 159(2) (2), 271 - 277, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2015年02月, JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, 119(2) (2), 140 - 147, 英語, 国内誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 微生物から高等生物まで広く存在する「N-アセチルトランスフェラーゼ」は，さまざまな基質をアセチル化することで，多くの重要な細胞機能の制御に関与している．筆者らは，環状の二級アミンであるプロリンアナログ（L-アゼチジン-2-カルボン酸，シス-4-ヒドロキシ-L-プロリン）を基質とする新規のN-アセチルトランスフェラーゼMpr1を酵母Saccharomyces cerevisiaeに見いだした．また，Mpr1がアルギニン合成を亢進することで一酸化窒素の生成を誘導し，酵母の酸化ストレス耐性に寄与する新しいタイプの「抗酸化酵素」であることを明らかにした．さらに，X線結晶構造解析により，Mpr1のユニークな立体構造と反応機構の解明にも成功した．本稿では，Mpr1の分子構造と生理的役割について概説する．また，Mpr1の酵素特性や生理機能に基づく応用研究の成果も紹介する．公益社団法人 日本農芸化学会, 2015年, 化学と生物, 53(3) (3), 148 - 155, 日本語
- 2014年11月, PLOS ONE, 9(11) (11), e113788, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- The basic amino acid histidine inhibited yeast cell growth more severely than lysine and arginine. Overexpression of CTR1, which encodes a high-affinity copper transporter on the plasma membrane, or addition of copper to the medium alleviated this cytotoxicity. However, the intracellular level of copper ions was not decreased in the presence of excess histidine. These results indicate that histidine cytotoxicity is associated with low copper availability inside cells, not with impaired copper uptake. Furthermore, histidine did not affect cell growth under limited respiration conditions, suggesting that histidine cytotoxicity is involved in deficiency of mitochondrial copper.2014年07月, Microbial cell (Graz, Austria), 1(7) (7), 241 - 246, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 29, 2013年07月, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(29) (29), 11821 - 11826, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2012年08月, JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, 114(2) (2), 160 - 165, 英語, 国内誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 2012年07月, FEBS letters, 586(16) (16), 2411 - 2416, 英語, 国際誌[査読有り]研究論文（学術雑誌）
- 日本農芸化学会 ; 1962-, 2017年09月, 化学と生物 : 日本農芸化学会会誌 : 生命・食・環境, 55(9) (9), 617 - 623, 日本語酵母に見いだした一酸化窒素(NO)の合成制御機構と生理機能 : 薬にも毒にもなる一酸化窒素の使い方
- 2017年, 日本生化学会大会(Web), 90th酵母における活性イオウ分子種:システインパースルフィドの生理的役割の解明
- 2016年, 日本酸化ストレス学会学術集会プログラム・抄録集, 69th酵母における活性イオウ分子種:システインパースルフィドの産生とその生理的役割
- 2015年09月, YEAST, 32, S131 - S132, 英語Regulatory mechanism and physiological role of the flavoprotein Tah18-dependent Nitric Oxide synthesis in yeast研究発表ペーパー・要旨（国際会議）
- 2014年11月, NITRIC OXIDE-BIOLOGY AND CHEMISTRY, 42, 134 - 135, 英語研究発表ペーパー・要旨（国際会議）
- 日本生物工学会, 2014年08月05日, 日本生物工学会大会講演要旨集, 66, 61, 日本語1P-175 イソアミルアルコールを高生産するロイシン蓄積泡盛酵母の単離と特性解析(醸造学,醸造工学,一般講演)
■ 共同研究・競争的資金等の研究課題
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 基盤研究(C), 奈良先端科学技術大学院大学, 2022年04月01日 - 2025年03月31日酵母におけるニトロ化タンパク質還元酵素の同定と機能解析
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(S), 基盤研究(S), 奈良先端科学技術大学院大学, 2019年06月26日 - 2024年03月31日１．酵母におけるNOの分子機能の解明 酵母NOS様活性の責任分子と考えられる酸化酵素Oxyを同定する目的で、モノオキシゲナーゼ活性を有する酵母タンパク質を解析した。3種類のP450酵素の遺伝子破壊・発現抑制株を作製し、過酸化水素処理条件下におけるNO合成について、NO反応性蛍光プローブを用いたフローサイトメトリーにより評価した。その結果、ラノステロール-14α-デメチラーゼをコードするERG11の発現抑制株において、NO由来の蛍光が減少した。また、Erg11阻害剤を処理した場合も同様の現象が観察された。以上のことから、ERG11が酵母NOS様活性のOxyをコードする可能性が示唆された。酵母のNO耐性に寄与する新たな遺伝子を探索した結果、リボフラビン合成の初発酵素であるGTP cyclohydrolase II（GCH2）をコードするRIB1遺伝子の過剰発現が、NOドナー処理時の細胞内NO濃度を低下させるとともに、細胞生存率の低下を抑制することを見出し、RIB1を新規なNO耐性遺伝子として同定した。また、組換え酵素を用いた生化学的解析等の結果、GCH2の活性によって生成する代謝中間体（DARP）がNOを消去することを明らかにした。 ２．糸状菌におけるNOの分子機能の解明 病原性糸状菌A. fumigatusを対象に、各種ストレス処理時におけるNO産生を解析した。その結果、植物や微生物が産生する天然抗菌物質（ファルネソール、チモール、ピオシアニン等）の処理に対して細胞内にNOが産生されることが明らかになった。麹菌A. oryzaeの転写因子を対象に、NOドナーに対して生育が低下する株を探索した。その結果、エルゴステロール合成系の制御や低酸素応答に重要な転写因子、亜鉛ホメオスタシスやプロリン代謝への関与が予想される転写因子などが候補として見出された。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽), 挑戦的研究(萌芽), 奈良先端科学技術大学院大学, 2019年06月28日 - 2022年03月31日酵母に見出したプロリン代謝酵素の多機能性の解明と細胞機能の向上への挑戦プロリンはワインの原料であるブドウ果汁に最も多く含まれているアミノ酸であるが、発酵中の酵母はプロリンをほとんど利用することができず、発酵後も多量に残存することが知られている。残存したプロリンは苦味の増加や酸味の減少を引き起こし、最終製品であるワインの酒質を低下させる。そこで、発酵環境下においてプロリンを効率良く資化できる酵母の創製を目的に、プロリン資化抑制に関わる因子を同定し、解析を行った。プロリン資化能を酵母の生育によって評価するために、プロリン要求性株を用いて解析したところ、ブドウ中に2番目に多い窒素源であるアルギニンが阻害因子であることを見出した。さらに、アルギニンはユビキチンリガーゼRsp5とそのアダプタータンパク質であるArt3依存的にプロリントランスポーターPut4のエンドサイトーシスを強力に誘導することで酵母のプロリン取込み能を抑制していることも判明した。現在、アルギニン存在下でもプロリン資化が可能な自然突然変異株を単離し、解析を行っている。 一方、酵母の寿命は分裂寿命と経時寿命に大別され、分裂寿命は母細胞から娘細胞が何回分裂できるか、経時寿命は分裂を停止した細胞がいつまで生存できるかをそれぞれ示している。今年度は細胞内プロリン含量が経時寿命に及ぼす影響について調べた。その結果、細胞内プロリン含量と経時寿命は無関係であり、プロリンオキシダーゼPut1をコードする遺伝子の欠損によって顕著に短くなることが判明した。Put1はプロリンを酸化分解し、電子とプロトンをミトコンドリア電子伝達系に送ることから、膜電位の形成維持に関わっている可能性がある。経時寿命は糖源が枯渇した条件下における細胞の恒常性維持であるため、プロリン-Put1経路によるエネルギー産生が経時寿命の制御に関わっている可能性がある。
- 日本学術振興会, 科研費 若手研究, 若手研究, 奈良先端科学技術大学院大学, 2019年04月 - 2022年03月31日, 研究代表者新規な網羅的定量解析系を用いた酵母の活性窒素種シグナルの総合的理解19年度までに同定したニトロ化修飾を受ける酵母タンパク質の内、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素Tdh3、ピルビン酸脱炭酸酵素Pdc1について、免疫沈降/ウェスタンブロット法により、ニトロ化修飾の再現性が確認された。また、Tdh3およびPdc1において、特定のチロシン残基のニトロ化が酵素活性を抑制することを見出した。Pdcは、ピルビン酸からアセトアルデヒドを合成する反応を触媒するため、NOが酵母の発酵力に影響を及ぼす可能性が示された。 一方、19年度の結果から、多くの代謝酵素のシステイン残基が細胞内ではNO依存的にS-ニトロソ化以外の修飾を受けている可能性が示された。そこで、抗グルタチオン抗体によるウェスタンブロット解析を行ったところ、多くのタンパク質が細胞のNO処理依存的にグルタチオン化（GSH化）修飾を受けることが明らかになった。また、免疫沈降法/ウェスタンブロット法によりフルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼFba1がGSH化されることを示した。さらに、免疫沈降/質量分析法により、Fba1のGSH化修飾部位も同定した。 上記のように、解糖系酵素がNOにより翻訳後修飾を受け、一部はこれにより阻害されることから、NO処理した酵母細胞の代謝物をLC/MS/MS解析により定量した。その結果、NO処理により、解糖系の前半部に位置しFba1の基質であるフルクトース-1,6-二リン酸が減少し、ペントースリン酸回路（PPP）の中間体である6-ホスホグルコン酸が増加した。一方、解糖系後半部のホスホエノールピルビン酸の量は、NO処理により変化しなかった。これらのことから、NO処理に応答して細胞内の代謝が解糖系からPPPへと変化している可能性が示唆された。PPPはNADPH合成に重要であるため、この代謝変化がNO耐性等に寄与する可能性が考えられた。競争的資金
- 公益財団法人 日本応用酵素協会, 酵素研究助成, 2022年, 研究代表者ニトロ化タンパク質の脱ニトロ化・還元酵素の同定と機能解析
- 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, イノベーション創出強化研究推進事業, 2018年04月 - 2021年03月, 研究分担者機能性アミノ酸高含有酵母の育種技術を活用した発酵・醸造食品の高付加価値化および海外ブランド化
- 公益財団法人 日本応用酵素協会, 酵素研究助成, 2020年, 研究代表者ニトロ化タンパク質の脱ニトロ化・還元酵素の探索・同定・機能解析
- 公益財団法人 持田記念医学薬学振興財団, 研究助成, 2020年, 研究代表者真菌の一酸化窒素耐性に関与する酵素GTP cyclohydrolase II を標的とした新規抗生物質の探索と開発
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(A), 基盤研究(A), 奈良先端科学技術大学院大学, 2016年04月01日 - 2019年03月31日真菌におけるNOの合成制御機構と生理機能を解明するとともに、NOが酵母の発酵力や病原真菌の表現型に及ぼす影響を解析した。その結果、NOS活性に必要なNADPHの生成に関わる酵素を同定した。また、Tah18の哺乳類オルソログNDOR1が酵母のNO合成に関与することを見出し、新規なNO合成機構が真核生物に保存されている可能性を示した。さらに、ビオチンスイッチ法を確立し、NOによりS-ニトロソ化されるタンパク質候補を多数同定した。一方、病原真菌ではCandida属の多剤耐性株やAspergillus fumigatusの臨床株の中にNO量やNO耐性の低い株が存在し、NOと病原性との関連が示唆された。
- 日本学術振興会, 科研費 若手研究(B), 若手研究(B), 奈良先端科学技術大学院大学, 2015年04月 - 2019年03月, 研究代表者本課題では、タンパク質ニトロ化によるシグナル経路の消去系酵素denitraseを、酵母をモデル生物として同定することを試みた。グルタミン合成酵素（GS）をモデル基質として酵母denitrase活性の検出を試みたところ、酵母粗酵素液からニトロ化GSに対する明確なdenitrase活性を検出した。また、亜硝酸処理条件下で多数の代謝酵素がニトロ化されることを見出した。競争的資金
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(A), 基盤研究(A), 奈良先端科学技術大学院大学, 2013年10月21日 - 2016年03月31日酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、Dre2がTah18依存的なNO合成を阻害すること、酸化ストレスに応答して、Dre2がTah18との複合体から解離することを見出し、Dre2によるNO合成の制御機構を提唱した。また、NOは高温ストレス耐性に寄与する一方で、高濃度の過酸化水素存在下で細胞死を誘導することから、二面性（細胞保護・細胞毒性）が示唆された。さらに、病原真菌（Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus）において、NOと増殖・感染・病原性との関連を示唆する結果を得た。
- 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 挑戦的萌芽研究, 挑戦的萌芽研究, 奈良先端科学技術大学院大学, 2013年04月01日 - 2016年03月31日最近明らかにしたMpr1の立体構造に基づいて理論的な分子設計を行い、分子内相互作用の強化によって野生型酵素に比べて熱安定性が著しく向上したMpr1変異体（Asn203Lys-Mpr1）を取得した。また、同変異体を発現する酵母ではMpr1を介したアルギニン合成能が亢進し、同変異体の有用性が認められた。次に、Mpr1の細胞内における基質と生成物の同定、および触媒反応を含め、Mpr1依存的なアルギニン合成経路の解明を試みた。その結果、Mpr1依存的に合成されたN-アセチルプロリンがアルギニン合成の中間代謝物質として、またはアルギニン代謝酵素の制御分子として機能する可能性が示された。
- 公益財団法人 野田産業科学研究所, 奨励研究助成, 2016年, 研究代表者酵母のN-アセチルトランスフェラーゼMpr1依存的な新規アルギニン代謝制御機構の解析